物质发射的波长差大于等于30nm。
[0040] 加样垫2为具有过滤作用的材质，加样垫2的材质为玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸 或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲 液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的玻璃纤维、聚酯膜、海绵、滤纸；
[0041] 标记物结合垫3的材质为玻璃纤维、聚酯膜或经过添加有表面活性剂、糖类、蛋白 类、高分子多聚物、盐类中的一种或多种的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液浸泡预处理后的 玻璃纤维或聚酯膜；
[0042] 检测垫4为具有强疏水特性的多孔材料，检测垫4的材质为硝酸纤维素膜或醋酸 纤维素膜，T线和C线至少为一条。
[0043] -种彩色-荧光双功能免疫层析试纸条的制备方法包括以下步骤：
[0044] (I)加样垫2的制备
[0045] 用含有EDTA、tween-20、PVP和BSA的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维、聚酯膜、海绵或滤 纸，然后置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用；
[0046] (II)标记物结合垫3的制备
[0047] 用含有海藻糖、牛血清白蛋白、tween-20和PVP的PBS缓冲液浸泡玻璃纤维或聚 酯膜，然后置于烘箱中烘干，再将彩色-荧光双功能微球标记物探针喷涂于处理烘干后的 玻璃纤维或聚酯膜上，再次置于烘箱中烘干，密封干燥保存备用。
[0048] 上述彩色-荧光双功能微球标记物探针具体制备方法如下：
[0049] (a)微球的制备：取聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯吡啶、聚乙基丙烯酸甲 酯、脂质和二氧化硅中的一种溶于十二烷基磺酸钠的去离子水中搅拌均匀，对其进行去除 空气密封并加热，解除密封后加入过硫酸钾搅拌，然后对搅拌液过滤，对收集的滤液离心纯 化，得到微球，备用；
[0050] (b)彩色-荧光双功能微球的制备：在去离子水中加入二氯甲烷或四氢呋喃和步 骤（a)制备完成的微球，得微球溶液，将溶于二氯甲烷或四氢呋喃的荧光标记物和脂溶性 彩色颜料逐滴加入微球溶液中并密封搅拌均匀，然后解除密封并去除二氯甲烷或四氢呋 喃，最后离心处理，得到彩色-荧光双功能微球，备用；
[0051] (c)待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物的制备：用缓冲液稀释步骤（b)制 备完成的彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，于摇床上活化后， 离心处理，去除上清液，加入缓冲液对沉淀复溶，然后加入与待测物相关的抗原抗体或配体 受体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密封过夜，最后离心处理，去除上清 液，再用缓冲液对沉淀复溶，超声处理，制得待测物抗体彩色-荧光双功能微球标记物；
[0052] (d)兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微 球标记物的制备：用缓冲液稀释彩色-荧光双功能微球，加入碳二亚胺和兔、鼠或其他与待 测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体，于摇床上偶联，然后加入乙醇胺和牛血清白蛋白，密 封过夜，最后离心处理，去除上清液，再用缓冲液复溶，超声处理，制得兔、鼠或其他与待测 物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光双功能微球标记物彩色-荧光微球标记物；
[0053] (e)彩色-荧光双功能微球标记物探针的制备：待测物抗体彩色-荧光双功能微 球标记物与兔、鼠或其他与待测物抗原抗体无交叉反应的抗原抗体彩色-荧光微球标记物 混合并喷于结合垫上，制得彩色-荧光双功能微球标记物探针。
[0054] (III)检测垫4的制备
[0055] 检测线T线41的包被：将与待测物相关的抗原抗体或配体受体用含有海藻糖和 SDS的PBS缓冲液溶解，制得喷涂液一，将喷涂液一喷涂在距检测垫4左端12mm处形成检测 线T线41 ;
[0056] 质控线C线42的包被：将与待测物无关的抗原的抗体或配体受体用含有海藻糖和 SDS的磷酸缓冲液溶解，制得喷涂液二，将喷涂液二喷涂在距检测垫4左端18mm处形成质控 线C线42 ;
[0057] 将喷涂好的检测垫4干燥保存备用；
[0058] (IV)试纸条的组装
[0059] 在PVC底板1上依次搭接处理过的加样垫2、喷有彩色-荧光双功能微球标记物探 针的标记物结合垫3、喷涂有检测线T线41和质控线C线42的检测垫4以及吸水垫5,组 装完毕后剪切成4_宽的试纸条即可。
[0060] 具体实施例
[0061] 实施例1
[0062] 黄曲霉毒素Ml蓝色-时间分辨荧光双功能免疫层析试纸条
[0063] 一、试纸条的制备方法
[0064] (a)微球的制备
[0065] 取8mmol的苯乙稀单体和0. 8mmol的丙稀酸单体溶解于10ml含0. 3mmol的十二 烷基磺酸钠的去离子水中，将混合液加入圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯 氮气将圆底烧瓶中空气除尽，密封加热至70°C，加入0. 3ml0. 2mmol的过硫酸钾，密封隔氧 搅拌反应8h后，降至室温。然后将反应液用孔径为8μm的滤纸过滤，收集滤液离心纯化， 离心条件为50000g10°C恒温离心15min，去除上清液，用5ml去离子水复溶沉淀，反复洗涤 三遍，最后加入浓度为0. 05%的十二烷基磺酸钠和浓度为0. 05%的叠氮化钠于4°C保存。 通过调节加入丙烯酸的单体的量即可得到微球表面不同的羧基密度；通过调节十二烷基磺 酸钠和过硫酸钾的量，即可制备不同粒径的微球。
[0066] (b)蓝色-时间分辨荧光双功能微球的制备
[0067] 取1ml固含量为10%的上述制备完成的微球，加入9ml去离子水中，再加入3ml 二氯甲烷，置于37°C恒温环境中，磁力搅拌30min，得预处理微球溶液。取10mg铕螯合物 (Eu:β-NTA:Τ0Ρ0 = 1 :3 :3)和5mg分散蓝2BLN，溶解于lml二氯甲烷中，然后将上述溶液 逐滴加入预处理微球溶液中，密封，37°C恒温磁力搅拌5h。然后打开密封盖子，使溶液体系 中的二氯甲烷在37°C条件下挥发干净。将溶液转入离心管中，离心洗涤三次，离心条件为： 50000g10°C恒温离心15min。去上清，前两次离心得的沉淀用50%的乙醇复溶，最后一次 离心得的沉淀用l〇mlpH8. 0的0. 05M硼酸缓冲液复溶，再加入浓度为0. 05%的十二烷基磺 酸钠和浓度为〇. 05%的叠氮化钠4°C保存。
[0068] (c)黄曲霉毒素Ml抗体蓝色-时间分辨荧光微球标记物的制备
[0069] 取固含量为1 %的上述蓝色-时间分辨荧光双功能微球100μL稀释于浓度为 0· 05mol/L、ρΗ8· 0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL浓度为10mg/mL的碳二亚胺（EDC) (购自上海晶纯生化科技股份有限公司）和60μL浓度为10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)(购自上海晶纯生化科技股份有限公司），将上述混合液室温条件下置于旋转摇床上 在50转/分钟条件下活化15min，然后40000g离心lOmin，去除上清液，用0. 05mol/L、pH8. 0 的硼酸缓冲液复溶沉淀，然后80W超声处理30S，加入25μg黄曲霉毒素Ml鼠单抗（购自上 海飞测生物科技有限公司），室温置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L 的乙醇胺（购自上海晶纯生化科技股份有限公司）、10 %的BSA(购自上海西宝生物科技有 限公司）溶液50μL封闭过夜。最后40000g离心lOmin，用0. 05mol/L、pH8. 0的硼酸缓冲 液复溶沉淀，反复洗涤2~3次，然后80W超声处理30S，置于4~8°C冰箱中保存备用。
[0070] (d)兔IgG蓝色-时间分辨荧光微球标记物的制备
[0071] 取固含量为1 %的上述蓝色-时间分辨荧光双功能微球100μL稀释于0.05mol/ L、pH8. 0的400μL硼酸缓冲液中，加入30μL10mg/mL的碳二亚胺（EDC)(购自上海晶纯生 化科技股份有限公司），再加入100μg兔IgG(购自长沙博优生物科技有限公司），将上述 混合液室温条件下置于旋转摇床上50转/分钟偶联2小时，加入50mmol/L的乙醇胺（购 自上海晶纯生化科技股份有限公司）、10 %的BSA(购自上海西宝生物科技有限公司）溶液 50μL封闭过夜。最后40000g离心10分钟，用0. 05mol/LpH8. 0的硼酸缓冲液复溶沉淀， 反复洗涤2~3次，然后80W超声处理30S，置于4~8°C冰箱中保存备用。
[0072] (e)试纸条的制备
[0073] (I)加样垫2的制备
[0074] 用含有 10mmol/L的EDTA、1% (v/v)的tween-20、0. 5% (m/v)的PVP、0. 5% (m/ v)的BSA的PBS缓冲液（0. 2mol/L，pH8. 0)浸泡玻璃纤维素膜加样垫，然后置于37°C烘箱 中烘烤2小时至完全干燥，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0075] (II)标记物结合垫3的制备
[0076] 首先用含有2. 5 % (m/v)的海藻糖、1 % (m/v)的牛血清白蛋白、1 % (v/v)的 tween-20、0. 5% (m/v)的PVP的0·lmol/LρΗ7· 4的磷酸缓冲液浸泡结合垫Fusion5 (购自 GE公司），然后置于37°C烘箱中烘干2小时。再将上述制备完成的黄曲霉毒素Ml抗体蓝 色-时间分辨焚光微球标记物和兔IgG蓝色-时间分辨焚光微球标记物用0.lmol/L、pH7. 4 的磷酸缓冲液分别稀释500倍和1200倍后混合制成黄曲霉毒素Ml抗体蓝色-荧光双功能 微球标记物探针，将上述探针用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5上，置于37°C烘箱中烘 干2小时后，置于密封干燥包装袋中保存备用。
[0077] (III)检测垫4的制备
[0078] 检测线T线41的包被
[0079] 将黄曲霉毒素Ml与牛血清白蛋白偶联物（购自上海飞测生物科技有限公司）用 含有1. 5% (m/v)的海藻糖和0· 05% (v/v)的SDS的浓度为0· 01m〇l/L、pH7. 4的磷酸缓冲 液溶解至终浓度为〇. 〇25mg/mL，将上述混合液用喷膜机喷涂在距硝酸纤维素膜左端12mm 处形成检测线T线41。
[0080] 质控线C线42的包被
[0081]