一种检测呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。
【背景技术】
[0002]硝基呋喃类(Nitrofurans)是一种广谱抗生素药物，主要包括呋喃它酮(Furaltadone)，呋喃挫酮(Furazolidone)，呋喃妥因(Furantoin)，和呋喃西林(Nitrofurazone)，通过干扰细菌的糖代谢而具有很好的抑菌杀菌作用。主要针对多种革兰氏阳性菌(葡萄球菌、链球菌、梭菌和棒状杆状菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、组织滴虫属和痢疾阿米巴)，并对一些原虫、真菌有一定得作用。硝基呋喃类抗生素同时具有促生长的作用。因其价格低廉且效果较好，抑菌受生物机制影响小，作为外用时对组织的刺激较小，而且菌类对其较少产生耐药性因而被广泛的应用于畜牧业和水产养殖业。硝基呋喃类药物在动物体内极不稳定，很快被代谢完全。进入动物体内后12h即可代谢完毕，但其代谢物分子(ΑΜ0Ζ，AHD，Α0Ζ，SEM)与体内蛋白结合保持长期稳定状态，可残留数周不易代谢出体外极为稳定，通过加工加热等方法(如煎，炸，烤，炖或微波加热等)难以是其分解。这种与蛋白结合状态存在的代谢物对人体造成一定的毒副作用。因此对硝基呋喃类药物的残留检测主要检测其代谢物的残留。目前检测硝基呋喃类抗生素及其代谢物残留的方法主要有:液相色谱质谱联用法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、液相色谱-紫外法(HPLC-UV)、原子吸收法、紫外分光光度法、酶联免疫法(ELISA)。其中液相色谱串联质谱法是广泛应用的确证方法，方法准确性高，但是前处理方法繁琐，需要昂贵的仪器以及专业的人员操作，检测费用昂贵，不适合进行现场快速检测。因此，积极发展一种灵敏度高、快速、简便的药物残留检测手段势在必行。免疫检测方法，可有效避免样品处理，仪器等因素的制约，而且方法的特异性强，灵敏度高，甚至可以制成试纸用于现场快速检测。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的呋喃它酮代谢物残留检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单的检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。
【发明内容】
[0003]本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的呋喃它酮代谢物的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的呋喃它酮代谢物的目的。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0005]封闭胶的制备
[0006](1)溶胀:称取0.5g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HC1溶液中，搅拌溶胀15min。
[0007](2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HC1淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。
[0008](3)封闭:加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。
[0009](4)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。
[0010](5)贮存:待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0011 ] 呋喃它酮代谢物抗体胶和HRP抗体胶的制备
[0012](1)溶胀:准确称取0.25g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到20mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀15min。
[0013](2)淋洗:将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mL HCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。
[0014](3)偶联抗体:取0.5mg(l.00mg/mL)抗体，用lmL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。
[0015](4)封闭:加入10mL的偶联缓冲液淋洗柱子，然后加入10mL的封闭液，再次密封柱子，室温震汤反应2h。
[0016](5)清洗:首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍；
[0017](6)贮存:待清洗液抽空，制备好的抗体胶用PBS悬起，约5mL PBS (含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4°C保存待用。
[0018]HRP抗体胶和呋喃它酮代谢物抗体胶的制备过程相同，只是偶联不同的抗体。
[0019]将所述封闭胶和抗体胶(HRP抗体胶)按一定比例混合制备凝胶检测柱的质控层和检测层，即:
[0020](1)质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取150 μ L混合胶加入到lmL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出；
[0021](2)检测层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取150 μ L加入其中，用注射器活塞将PBS压出；
[0022]进一步的，所述质控层和检测层，制备检测柱，即:
[0023](1)检测柱由下到上，分别是对照层和检测层，对照层和检测层之间隔开一个3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从对照层迀移到检测层中。
[0024](2)首先将聚乙烯垫片加入lmL的塑料柱中，然后加入对照层混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，在对照层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。
[0025]本发明创造所述的免疫检测柱相对于现有技术具有以下优势:
[0026](1)本发明提供的呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱，可专一识别呋喃它酮代谢物，具有非常高的选择性。
[0027](2)本发明呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱是一种可视化的定性半定量检测产品。对目标待测物的检测，检测柱会以检测层颜色的有无给出检测结果，即以是/否的可视定性信号给予应答，操作方便，结果判断简单。
[0028](3)本发明制得的呋喃它酮代谢物免疫亲和凝胶检测柱既可以使之与净化柱串联，消除样品基质影响；又可容纳较大体积的清洗缓冲液和样品溶液，提高了方法灵敏度。检测产品不需要任何复杂的前处理，及大型仪器的辅助，具有很好的易用性和准确性，满足现场快速检测的要求。
【附图说明】
[0029]构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
[0030]图1为本发明创造实施例所述的凝胶检测柱的组装示意图；
[0031]1-注射器，2-转接头，3-进样口，4-聚乙烯垫片，5-检测层，6-空气层，7-质控层，8-出口。
[0032]图2本发明创造实施例所述的呋喃它酮代谢物凝胶检测柱检测限的判定(ΝΡΑΜ0Ζ的浓度从左至右依次为:0 μ g/L, 5 μ g/L, 10 μ g/L, 20 μ g/L)；
[0033]图3为本发明创造实施例所述的呋喃它酮代谢物凝胶检测柱特异性的判定(与硝基呋喃类兽药结构类似物的交叉反应结果)，从左到右依次是:ΝΡΑΜ0Ζ、NPAOZ、NPAHD、NPSEM、呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林、ΑΜΟΖ、AOZ、AHD、SEM、邻硝基苯甲醛、对硝基苯甲酸(ΝΡΑΜ0Ζ浓度为20 μ g/L,呋喃它酮浓度为100 μ g/L，ΑΜ0Ζ浓度为300 μ g/L,其他均是 1000 μ g/L);
[0034]图4本发明创造实施例所述的呋喃它酮代谢物凝胶检测柱特异性的判定(与其它兽药的交叉反应结果)，左到右依次是:ΝΡΑΜ0Ζ ;恩诺沙星；氯霉素；链霉素；青霉素；甲硝唑；磺胺二甲嘧啶；磺胺多辛；四环素(ΝΡΑΜ0Ζ浓度为20 μ g/L,其他兽药均是1000 μ g/L);
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施来限定本发明的保护范围。
[0036]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
[0037]实施例1
[0038]1、呋喃它酮代谢物抗血清的纯化
[0039]采用Protein A — Sepharose 4B作亲合层析介质纯化呋喃它酮代谢物抗血清，可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体的操作步骤如下:(1)平衡:使用已配好的Binding缓冲液冲洗柱子，冲洗管路直到仪器绘出稳定的基线，流速为lmL/min。(2)上样:用等体积的Binding缓冲液稀释抗血清后上柱，流速调为0.5mL/min。(3)洗杂:继续用Binding缓冲液冲洗柱子，会出现杂蛋白峰被洗脱流出，而抗体IgG会吸附在ProteinA-SepHarose4B柱上，继续冲洗至仪器出现稳定基线，流速控制在1.0ml/min。⑷洗脱:用Elut1n缓冲液洗脱柱子，流速控制为0.5ml/min。洗脱过程中紫外信号线开始上升，电导信号线开始下降时，开始收集抗体蛋白，每个试管接1ml。用紫外可见分光光度计，在280nm下测收集液的0D值(Elut1n缓冲液调零)，保留0D值大于0.5的蛋白溶液，并迅速用lmol/L Tr1-HCl缓冲液调收集抗体的pH至为7.4。(5)用PB缓冲液透析72h,加入0.1 %(W/V)的叠氮钠，置4°C冰箱保存备用。用来制备凝胶检测柱检测层的抗体胶。
[0040]2、人工抗原的制备
[0041](1)半抗原CPAM0Z的合成
[0042]取10.0mg的ΑΜ0Ζ溶解于125 μ L的0.lmol/L的HC1中，搅拌溶解，此溶液为A液。取8.0mg的对醛基苯甲酸(4-CBA)，缓慢加入DMF (大约125 μ L)至其完全溶解，此溶液为Β液。Β液在搅拌中缓慢加入Α液，室温搅拌反应48h。将混合液离心(4500r/min) 15min，然后弃去清液，得到白色物质即为CPAM0Z，50°C真空干