专利名称：呋喃妥因代谢物检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒，特别是检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的试剂盒。背景技术：
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃妥因代谢产物AHD ;呋喃它酮代谢产物AMOZ ;呋喃唑酮代谢产物AOZ ;硝基糠腙(呋喃西林)代谢产物SEM。用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用AHD衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。(三)实用新型内容本实用新型提供一种小巧轻便的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其操作简便，检测灵敏度高，成本低，可进行一次连续进行多个样品中呋喃妥因代谢物残留量的测定，减少了检 测样本所需要的时间。呋喃妥因代谢物检测试剂盒，包括固相载体、放试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，固相载体上设有微孔条，微孔条包括微孔、包被层；试剂瓶包括装有呋喃妥因代谢物单克隆抗体溶液的试剂瓶、装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体的试剂瓶。所述包被层由呋喃妥因代谢物偶联抗原组成。所述试剂盒还包括6瓶装有呋喃妥因代谢物标准液的试剂瓶，2瓶装有底物显色液的试剂瓶，I瓶装有终止液的试剂瓶，I瓶装有洗涤液的试剂瓶，I瓶装有缓冲液的试剂瓶，I瓶装有衍生化试剂的试剂瓶。所述固相载体由96孔聚苯乙烯试剂板组成。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。检测时，样本中的呋喃妥因代谢物将和微孔条包被层的呋喃妥因代谢物偶联抗原竞争呋喃妥因代谢物单克隆抗体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体后，用底物显色液显色，样本吸光度值与样本中呋喃妥因代谢物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃妥因代谢物残留量。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度检测灵敏度为0.1 μ g/L。相对于其他呋喃妥因代谢物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的检测。
[0013]图1本实用新型试剂盒的固相载体一列微孔条图。图2本实用新型固相载体图。图3本实用新型盒体、下凹瓶位结构示意具体实施方式
如图1至图3所示，呋喃妥因代谢物检测试剂盒，盒体I内具有固定模具形成的下凹瓶位2，下凹瓶位用于放置装有溶液的试剂瓶，96孔聚苯乙烯试剂板组成的固相载体3，固相载体的的微孔条4包括微孔5和包被层6，包被层由呋喃妥因代谢物偶联抗原组成，试剂瓶包括装有呋喃妥因代谢物单克隆抗体溶液的试剂瓶、装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体的试剂瓶。为了更有利于检测呋喃妥因代谢物残留的检测，试剂盒还可以包括有6瓶装有呋喃妥因代谢物标准液的试剂瓶，2瓶装有底物显色液的试剂瓶，I瓶装有终止液的试剂瓶，I瓶装有洗涤液的试剂瓶，I瓶装有缓冲液的试剂瓶，I瓶装有衍生化试剂的试剂瓶。试剂盒的试剂瓶内的具体成分如下( I)呋喃妥因代谢物单克隆抗体工作液IOml /瓶；(2)呋喃妥因代谢物标准品溶液Iml/瓶，浓度分别为0 ii g/L、0.1 U g/L、0. 3 U g/L、0.9u g/L、2. 7u g/L、8.1u g/L ；(3)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液12ml/瓶；(4)底物显色液，分别为底物显色A液，底物显色B液，底物显色液A液为过氧化脲7ml/瓶，底物显色液B液为四甲基联苯胺7ml/瓶；(5)终止液 7ml/瓶；(6)缓冲液50ml/瓶，为pH值为7. 2,0. 2-0. 5mol/L磷酸盐缓冲液。使用时2倍稀释。(7)洗涤液 40ml/ 瓶，为含有 0. 6%_0. 8% 吐温 _20、0. 05% 硫柳汞、0. 02mol/L 磷酸盐缓冲液。使用时20倍稀释。(5)衍生化试剂15.1mg/瓶，衍生化试剂为2_硝基苯甲醛。试剂盒中用到的主要材料的制备方法呋喃妥因代谢物偶联抗原的制备( I)呋喃妥因代谢物半抗原的制备呋喃妥因代谢物与对羧基苯甲醛通过反应得到。(2)呋喃妥因代谢物偶联抗原的制备将呋喃妥因代谢物半抗原与卵清蛋白通过混合酸酐法偶联得到呋喃妥因代谢物偶联抗原。呋喃妥因代谢物单克隆抗体的制备( I)动物免疫将免疫原(呋喃妥因代谢物半抗原与牛血清白蛋白通过混合酸酐法偶联得到)注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为IOOii g/只，使其产生多克隆抗体血清。(2)细胞融合和克隆化小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按9:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏将呋喃妥因代谢物单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成I X IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的生产与纯化将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油O. 5ml/只，7天后腹腔注射呋喃妥因代谢物单克隆杂交瘤细胞株5X IO7个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20°C保存。(5)羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免 疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。(6)辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体的制备将羊抗鼠抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联得到。(—)使用呋喃妥因代谢物检测试剂盒检测呋喃妥因代谢物的操作步骤1、取出需要数量的微孔板。2、加标准品/样本加标准品/样本50 μ I到对应的微孔中，在加入咲喃妥因代谢物单克隆抗体工作液50 μ I/孔，轻轻振荡混匀，置25°C避光环境中反应30min。3、洗板将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ I/孔，充分洗涤4 — 5次，每次间隔IOs,用吸水纸拍干。4、酶标二抗加酶标二抗工作液100 μ I到对应的微孔中，轻轻振荡混匀，置25V避光环境中反应30min。5、显色加入底物液显色液各50 μ I/孔，混匀，置25°C避光环境中反应15min。6、测定加入终止液50 μ I/孔,混勻，设定酶标仪于450nm处测定每孔OD值。(二)结果判定(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即
权利要求1.一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒，包括固相载体、放试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，其特征在于固相载体上设有微孔条，微孔条包括微孔、包被层；试剂瓶包括装有呋喃妥因代谢物单克隆抗体溶液的试剂瓶、装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体的试剂瓶。
2.如权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于所述包被层由呋喃妥因代谢物偶联抗原组成。
3.如权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括6瓶装有呋喃妥因代谢物标准液的试剂瓶，2瓶装有显色液的试剂瓶，I瓶装有终止液的试剂瓶，I瓶装有洗涤液的试剂瓶，I瓶装有缓冲液的试剂瓶，I瓶装有衍生化试剂的试剂瓶。
4.如权利要求1所述的呋喃妥因代谢物检测试剂盒，其特征在于所述固相载体由96孔聚苯乙烯试剂板组成。
专利摘要本实用新型涉及一种呋喃妥因代谢物检测试剂盒。该试剂盒包括固相载体、放试剂的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶，固相载体上设有微孔条，微孔条包括微孔、包被层，包被层由呋喃妥因代谢物偶联抗原组成；试剂瓶包括装有呋喃妥因代谢物单克隆抗体溶液的试剂瓶、装有辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体的试剂瓶。本实用新型试剂盒可用于呋喃妥因代谢物的残留量检测，与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度、检测样本量大等特点。
文档编号G01N33/577GK202903799SQ201220552158
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者何方洋, 余厚美, 刘福林, 蒲小容, 何丽霞, 王建霞, 段盈盈 申请人:北京勤邦生物技术有限公司