专利名称：呋喃它酮代谢物elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及呋喃它酮代谢物残留量的检测试剂盒，特别是检 测水产品中呋喃它酮代谢物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之 后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝 基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药 物禁止在治疗和饲料中使用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存 留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门 就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃唑酮代谢产物AOZ ；呋喃 它酮代谢产物AMOZ ；硝基呋喃托英代谢产物AHD ；硝基糠腙(呋喃西林)代谢产物SEM。用来检测呋喃它酮代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS，但其检测样 本的操作步骤麻烦，检测时间长，一次性检测样本少。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的呋喃它 酮代谢物残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要 的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中呋喃它酮代谢物残留量的测定，减少了检验 样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种呋喃它酮代谢物ELISA检测试剂盒，包括盒体和 盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、15瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份 说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微 孔条上预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原制成的检测板，15瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、 酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基 苯甲醛，下凹瓶位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将15瓶瓶试剂用不同 大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说 明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。15瓶试剂分别为7瓶Iml标准品 溶液、12ml酶标二抗、7ml抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml 浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液，15. Img 2-硝基苯甲醛。每一个试剂盒中的试剂足够进行96 次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检 测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测 时，样本中的残留的呋喃它酮代谢物将和酶标板微孔条上预包被的偶联呋喃它酮代谢物抗 原竞争抗呋喃它酮代谢物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中 所含有呋喃它酮代谢物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃它酮代谢物的残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度鱼虾样品的最低检测限为0. 15 μ g/ kg ；鱼虾组织的回收率为75% 士 15%，同其他呋喃它酮代谢物类似药物的交叉反应率为 < 0. 1%。相对于其他呋喃它酮代谢物残留检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标 仪、勻质器、振荡机、微量加样器、离心机等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。 本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于水产品中呋喃它酮代 谢物残留的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被呋喃它酮代谢物偶联抗原(3)固定于酶标 板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置恒 温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜的大小与试剂板横切面的大小一致；透明 帽的半透明PE塑料瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料瓶(5)用于 封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽 (6)的黑色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于 封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑 料瓶(8)用于封装7ml抗体工作液，黑色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装15. Img 2-硝基 苯甲醛，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10) 有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显 色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml抗体工作液瓶位 (16)，12ml酶标二抗瓶位(15)，7种Iml/瓶各种浓度的标准品溶液及15. Img 2-硝基苯甲 醛的瓶位(17)，盒体(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液配液1 衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至IOml (浓度为IOmM)。配液2 :0· IM磷酸氢二钾溶液称取22. Sg三水合磷酸氢二钾加去离子水溶解定容至1L。配液3: IM盐酸溶液量取8. 3ml浓盐酸加入到盛有去离子水的容器中定容至100ml。[0026]配液4 IM氢氧化钠溶液称取4. Og氢氧化钠加去离子水溶解定容至IOOml。配液5:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液6 洗涤液工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.水产(鱼虾等)组织前处理方法用均质器均质样本；称取1.0士0.05g均质后的组织样本，加入細1的去离子水、 0. 5ml IM盐酸溶液和100 μ 1衍生化试剂，用振荡器充分振荡^iin ；在37°C过夜孵育(大 约16h)；加入5ml 0. IM磷酸氢二钾溶液、0. 4ml IM氢氧化钠溶液和5ml乙酸乙酯，用振荡 器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温(20-250C /68-77° F)离心IOmin取2. 5ml乙酸乙酯相 至IOml干燥的玻璃试管中，于50 60°C氮气流下吹干加入Iml正己烷(或正庚烷)，用 涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动Imin充分混勻；3000g以上，室温 (20-250C /68-77F)离心IOmin ；除去上层有机相，取下层水相50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品溶液/样本溶液和抗体工作液加标准品溶液/样本溶液50 μ 1到对 应的微孔中，然后加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C避光 环境中反应30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处，测定每孔 OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与其所含呋喃它酮代谢物成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。假设样 本1的吸光度值为0. 301，样本2的吸光度值为0. 830，标准液吸光度值分别是0μ g/L为2. 018 ；0. 05 μ g/L 为 1. 475 ；0. 15 μ g/L 为 1. 030 ；0. 45 μ g/L 为 0. 472 ；1. 35 μ g/L 为 0. 187 ； 4. 05 μ g/L为0.079。则样本1的浓度范围是0. 45 μ g/L_l. 35 μ g/L再乘以其对应的稀 释倍数即可得出样本中呋喃它酮代谢物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 15 μ g/ L-0. 45 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃它酮代谢物残留的浓度范围。 2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸 光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％) = B/B0X100%B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃它酮代谢物标准品浓度(μ g/L)的半对数 为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本 所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃它酮代谢物的实际残留量。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性 不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中 的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2-8 °C，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可延 长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求1.一种呋喃它酮代谢物ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一 张盖板膜、15瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特 征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被呋喃它酮代谢 物偶联抗原制成的检测板，15瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色 液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗 用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶， 浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，2-硝基 苯甲醛用黑色帽的棕色玻璃瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；抗体工作液1 瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶， 40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml ；2-硝基苯甲醛1瓶，15. Imgo
专利摘要本实用新型涉及一种检测水产品中呋喃它酮代谢物的ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、抗体工作液、标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、2-硝基苯甲醛、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的呋喃它酮代谢物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃它酮代谢物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃它酮代谢物的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点。
文档编号G01N21/78GK201852835SQ201020586590
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何丽霞, 何方洋, 余厚美, 刘福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申请人:北京勤邦生物技术有限公司