专利名称：呋喃妥因代谢物elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测呋喃妥因代谢物残留量的试剂盒，特别是检 测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免 疫技术之后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经 被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝 基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药 物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存 留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门 就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃妥因代谢产物AHD ；呋喃 它酮代谢产物AMOZ ；呋喃唑酮代谢产物AOZ ；硝基糠腙(呋喃西林)代谢产物SEM。用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫 方法结合了色谱技术，采用AHD衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度和灵敏度，较低的 操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的呋喃妥 因代谢物残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需 要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中呋喃妥因代谢物残留量的测定，减少了检 测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种呋喃妥因代谢物ELISA检测试剂盒，包括盒体和 盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、15瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份 说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微 孔条上预包被呋喃妥因代谢物偶联抗原制成的检测板，15瓶试剂分别为-J瓶标准品溶液、 酶标二抗、抗体浓缩液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶 位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将15瓶试剂用不同大 小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明 书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便携带和运输。15瓶试剂分别为7瓶Iml梯度浓度的 标准品溶液、12ml酶标二抗、Iml抗体浓缩液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、 40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液、15. Img2_硝基苯甲醛。每一个试剂盒中的试剂足够进 行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开 多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。 检测时，样本中的呋喃妥因代谢物将和酶标板微孔条上预包被的呋喃妥因代谢物偶联抗原 竞争抗呋喃妥因代谢物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含呋喃妥因代谢物的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得 出样品中呋喃妥因代谢物残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度，为0. 1 μ g/kg 组织、蜂蜜、牛奶样本检 测下限为0. 2μ g/kg、虾、鱼等水产组织样本检测限为0. 3μ g/kg ；水产、肌肉、肝脏组织 样本的回收率为75% 士 15% ；蜂蜜样本的回收率为90% 士 15% ；奶样的回收率为90% 士 10%。相对于其他呋喃妥因代谢物检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮 气吹干装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本 较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于呋喃妥因代谢物残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被呋喃妥因代谢物偶联抗原(3)固定于酶标 板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴 或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料瓶(5)用 于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色 帽(6)的黑色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料瓶(7) 用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色 PE塑料瓶(8)用于封装7ml呋喃妥因代谢物抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用 于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓 缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位 (13)，7ml终止液瓶位(12)，Iml呋喃妥因代谢物抗体浓缩液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位 (15)，7个Iml/瓶各种浓度的标准品溶液和；15. Img 2-硝基苯甲醛瓶位(17)，盒体为(19) 是硬纸盒。
具体实施方式
样本的前处理1.配液配液1 衍生化试剂向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至IOml (浓度为IOmM)。配液2 :C液0. 36M亚硝基铁氰化钠(Na2Fe (CN) 5 · NO · 2H20)溶液称取12. 5g水合亚硝基铁氰化钠加去离子水定容至100ml。D液(供奶样专用)IM硫酸锌(ZnSO4 · 7H20)溶液称取29. 8g硫酸锌用去离子水定容至100ml。配液3 :0. IM磷酸氢二钾溶液称取22. 8g三水合磷酸氢二钾加去离子水定容至1L。配液4: IM盐酸溶液量取8. 3ml浓盐酸加去离子水定容至IOOml。配液5: IM氢氧化钠称取4. Og氢氧化钠加去离子水定容至IOOml。配液6:甲醇-水溶液量取甲醇90ml加去离子水IOml混勻。配液7:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液8 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2、肌肉、肝脏、水产(鱼虾等)组织前处理方法用均质器均质样本，取1. 0士0. 05g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中；加入5ml 甲醇-水溶液，用振荡器振荡5min，3000g以上离心lOmin，去除全部上清液；(本步骤可 降低样本基质干扰)加入細1的去离子水，用涡旋仪涡动溶解，加入0. 5ml IM盐酸溶液和 100 μ 1衍生化试剂，用振荡器充分振荡；接( 描述方法(标*处)。注样本应当保存在 阴凉避光之处及冷藏保存。3、牛奶前处理方法取牛奶样本，3000g以上，10°C离心lOmin，吸除上层脂肪；取出5ml去除脂肪牛奶 样本至IOml玻璃离心管中；分别加入250 μ 1 C液和250μ1 D液；用振荡器充分振荡混合， 3000g以上，4-12°C (39- ° F)离心lOmin。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约 8°C (46° F)，然后离心；取牛奶的离心上清液l.lml(相当于Iml奶样)，分别加入細1的 去离子水用振荡器振荡溶解，0. 5ml IM盐酸和100 μ 1衍生化试剂，充分振荡aiiin ；接(5) 描述方法(标*处)。4、蜂蜜前处理方法称取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；加入細1的去离子水，用振荡 器振荡至蜂蜜全部溶解；0. 5ml IM盐酸溶液和100 μ 1衍生化试剂，用振荡器充分振荡；接 (5)描述方法(标*处)。5、接上面的方法*在37 °C过夜孵育(大约16h)；分别加入5ml 0. IM磷酸氢二钾溶液、 0. ^illM氢氧化钠溶液和5ml的乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s ；3000g以上，室温 (20-250C/68-77° F)离心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃试管中，于50 60°C氮气流下吹干；用Iml的正己烷(或正庚烷)用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，用涡旋仪涡动Imin充分混勻；3000g以上，室温O0_25°C /68-77° F)离心IOmin ；除去 上层有机相，取下层水相50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 μ 1到对应的微孔 中，再加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置于25°C避光环境中反 应 30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色加入底物液A液50 μ 1/孔，再加底物液B液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻， 用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止 液用目测法可进行判定)。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与呋喃妥因代谢物含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。例如样 本1的吸光度值为0. 236，样本2的吸光度值为0. 666，标准品吸光度值分别是0 μ g/L 为 1. 949 ；0. 1 μ g/L 为 1. 434 ；0. 3 μ g/L 为· 939 ；0. 9 μ g/L 为 0. 487 ；2. 7 μ g/L 为 0. 157 ； 8. 1 μ g/L为0. 060。则样本1的浓度范围是0. 9 μ g/L-2. 7 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中呋喃妥因代谢物残留的浓度范围#本2的浓度范围是0. 3 μ g/L-0. 9 μ g/ L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃妥因代谢物残留的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算[0064]以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃妥因代谢物标准品浓度(μ g/L)的半对数 为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本 所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃妥因代谢物实际含量。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20-25°C )会导致所有标准的OD 值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性 不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中 的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标 准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可 延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求1.一种呋喃妥因代谢物ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一 张盖板膜、15瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特 征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被呋喃妥因代谢 物偶联抗原制成的检测板，15瓶试剂分别为-J瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、显色 液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗 用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶， 浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；抗体浓缩液1 瓶，Iml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶， 40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml ；2-硝基苯甲醛1瓶，15. Imgo
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中呋喃妥因代谢物残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、呋喃妥因代谢物抗体浓缩液、7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的呋喃妥因代谢物将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃妥因代谢物的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物源性食品中呋喃妥因代谢物的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01J3/42GK201852833SQ201020586580
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何丽霞, 何方洋, 余厚美, 刘福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申请人:北京勤邦生物技术有限公司