专利名称：卡那霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及卡那霉素残留量的酶联免疫试剂盒，特别是检测肌肉、肝脏中卡那霉素残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术卡那霉素是氨基糖甙类抗生素，被广范应用于动物疾病的治疗， 由于其具有神经毒性和肾脏毒性，在动物食品中的残留会影响人类健康，欧美国家及我国均要求其限量使用。卡那霉素残留量的常规检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MQ等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的卡那霉素残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术含量不高，可进行一次连续多个样品中卡那霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。本实用新型的技术方案是一种卡那霉素检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96 孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被卡那霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗工作液、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜； 标准品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶标二抗工作液用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明 PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被卡那霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗工作液1瓶，7ml ；抗体工作液 1瓶，IOml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶， 40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。将14瓶试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、 盖板膜、自封袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的卡那霉素将和酶标板微孔条上预包被的卡那霉素偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含卡那霉素的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度肌肉、肝脏样本的最低检测限为10 μ g/ kg，回收率范围均在75% 105%之间；相对于其他卡那霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、离心机、振荡机、涡旋仪、恒温水浴箱和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于卡那霉素残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图fe为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图恥为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图5c为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图5d为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被卡那霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条O)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料试剂瓶( 用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液， 红色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶( 用于封装7ml酶标二抗工作液，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装IOml卡那霉素抗体工作液，黑色帽的半透明PE塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A 液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(1 ，7ml终止液瓶位(1 ，IOml卡那霉素抗体工作液瓶位(16)，7ml酶标二抗工作液瓶位(1 ，7瓶Iml/瓶各种浓度的标准品溶液，盒体为(19) 是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液配液1 :0. IM PBS 溶液(PH = 10-11)称取13. 4g十二水合磷酸氢二钠、20g氯化钠、0. 32g氢氧化钠、0. 5g磷酸二氢钾、 0. 5g氯化钾，加去离子水溶解定溶至500ml。
4[0026]配液2 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。配液3:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)，用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。2.肌肉、肝脏样本处理步骤称取2. 0士0. 05g去除脂肪的粉碎样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml0. IM PBS (PH = 10 11)缓冲液，混勻IOmin ；放入60°C水浴环境中60min，取出水浴冷却至室温并摇勻；3000g以上，室温离心IOmin ；移取上清液，加入复溶工作液，以1 4的体积比进行稀释(100 μ 1上清液+400 μ 1复溶工作液)；取20 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品溶液/样本溶液加入标准品溶液/样本溶液20 μ 1到对应的微孔中， 加入酶标二抗50 μ 1/孔，再加入抗体工作液80 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置 25 °C避光环境中反应40min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中避光反应15min。8、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与卡那霉素残留量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(μ g/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 512，样本2的吸光度值为0. 899，标准液吸光度值分别是 ο μ g/L 为 1. 950 ；0. 2 μ g/L 为 1. 550 ；0. 6 μ g/L 为 1. 200 ； 1. 8 μ g/L 为 0. 650 ；5. 4 μ g/L 为0. 301 ；16. 2 μ g/L为0. 110。则样本1的浓度范围是4. 5 μ g/L_13. 5 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中卡那霉素残留量的浓度范围；样本2的浓度范围是1. 5 μ g/ L-4. 5μ g/L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中卡那霉素残留量的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即[0046]
权利要求1.一种卡那霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于 酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被卡那霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗工作液、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶标二抗工作液用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A 液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE 塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被卡那霉素偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/ 瓶；酶标二抗工作液1瓶，7ml ；抗体工作液1瓶，IOml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1 瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种卡那霉素残留量检测的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗工作液、卡那霉素抗体工作液、卡那霉素7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的卡那霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡那霉素的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在卡那霉素的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK201993364SQ201020586578
公开日2011年9月28日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何方洋, 余厚美, 冯月君, 刘福林, 罗贵昆, 蒲小容, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司