专利名称：用作抗肿瘤药的核苷的磷脂衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含用作肿瘤疾病或瘤形成例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的预防和/或治愈、缓解和/或支撑治疗的抗肿瘤或抗增生活性成分的磷脂衍生物的药物，所说的磷脂衍生物优选地是与通式I相一致的的非天然的核苷 其中R1表示具有10-14个碳原子的烷基链，R2表示具有8-12个碳原子的烷基链，n表示等于0、1或2的整数，R3表示羟基，R4和R5表示氢，和B表示5-氟尿嘧啶。与通式I相一致的磷脂衍生物还可以以其生理学上可耐受的碱或碱土金属盐的形式被提供。
核苷的磷脂-衍生物可以由公开的专利说明书EP 545 966 B1而被公知。该化合物被描述为具有抗病毒活性的物质，其特别适用于治疗和预防由DNA病毒如例如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、乳多空病毒科、水痘-带状疱疹病毒或Epstein-Barr病毒、或RNA病毒如例如披盖病毒科、或者特别是逆转录病毒如例如HTLV-I和HTLV-II肿瘤病毒、以及慢病毒亚科、绵羊脱髓鞘性脑白质炎(Visna)和人免疫缺陷病毒——HIV-1和HIV-2所造成的感染。此外，上面所列举的公开的专利文献强调通式I的化合物特别适于用来治疗人逆转录病毒HIV感染的临床表现，如顽固的泛化性淋巴结病(PGL)、与AIDS有关的综合症的晚期、以及AIDS的全部临床表现。这些化合物据称可以抑制病毒-特异的DNA或RNA转录阶段的DNA或RNA病毒的增生。
已经从Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，1911，1986和Nature325，773，1987中知道，所说的物质可以通过抑制酶——逆转录酶来抑制逆转录病毒的增生。本文中特别感兴趣的治疗益处是这些化合物对HIV——免疫缺陷疾病，AIDS的起因——的抑制作用。其在EP 545 966中清楚地指出，这些物质的抗病毒或抗逆转录病毒的功效与其在药理学相关剂量下的细胞毒作用无关。
在WO 95/32984中已经对具有抗肿瘤作用的核苷-单磷酸盐的脂类酯进行了描述。通过改变该糖环的C-2′-碳原子上的取代基模式，本发明的化合物与其中所要求保护的结构不同。
已经令人吃惊地发现，EP 545 966中的核苷的磷脂衍生物中的一些具有另外的有价值的药理学性质。这些物质特别适用于预防和/或治疗恶性肿瘤，如例如malignomas、瘤形成、癌、肉瘤、或血液学肿瘤疾病，如例如白血病。令人吃惊地是，本发明的化合物可以在药理学相关剂量下在对其它器官系统如例如骨髓或胃肠道不产生非特异性毒性作用的情况下起到抗肿瘤或抗增生作用。
本发明的化合物与下面的通式I相一致
其中R1表示具有10-14个碳原子的烷基链，R2表示具有8-12个碳原子的烷基链，n表示等于0、1或2的整数，R3、R4和R5彼此独立地各自表示氢或羟基，前提是R3和R4不能都是羟基，和B表示可能被改变的或被取代的核-碱基以及其生理学可耐受的无机酸或有机酸的盐，包括各种可能的对映异构体、非对映异构体或互变异构体。
优选地，通式I的核-碱基表示胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙烯基尿嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氯腺嘌呤、2-氟腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-溴腺嘌呤、6-巯基嘌呤或6-甲基巯基嘌呤。优选非天然的，并且特别是卤化的核-碱基。对于嘌呤碱基而言其优选地通过N9氮被连接到糖上，并且对于嘧啶碱基而言，其优选地通过N1-氮被连接。
优选的糖包括残基R3、R4和R5的如下组合
R3R4R5a)OH H OHb)OH H Hc)H OH Hd)H H OH在通式I中，R1优选地表示具有直链的C10-C14烷基。R1特别是表示癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基。R1特别优选地是表示十一烷基和十二烷基残基。
R2优选地表示具有直链的C8-C12烷基，特别是辛基、壬基、癸基、十一烷基或十二烷基。R2特别优选地是表示癸基和十一烷基残基。
特征为等于0、1或2的各种氧化状态的硫表示硫醚、亚砜或砜。特别优选地是硫醚和亚砜。
碱和碱土盐是通式I的化合物的优选盐。特别优选地是钠、钙、和镁盐。
特别优选的是其中R5表示氢的通式I的化合物。这些化合物的名称还没有被命名。
特别优选的是化合物5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基巯基-2-癸氧基)丙基酯以及其亚砜和砜衍生物(R1表示十二烷基，R2表示癸基，R4/R5表示氢，R3表示羟基，n表示0、1或2和B表示5-氟尿嘧啶)。之前，这些化合物在EP 545 966或WO 95/32984中都没有进行过描述，因此，其是新的。
在EP 0 545 966 B1和WO 95/32984中对与通式I的化合物的制备途径相似的途径进行了描述，其内容在这里被引入作为参考。
与迄今为止用于治疗恶性瘤形成或肿瘤的化疗剂相比较，本发明的化合物具有更高的药理学-医学效力、改善的功效和/或显著较低的毒性，因此，其在体内条件下具有更广的治疗范围。因为包含这些化合物的药物的给药可以被连续维持较长的时间，所以通式I的化合物在临床实践上是有利的。由于具有大量不希望出现的副作用，所以对于目前用于肿瘤的药物治疗的细胞生长抑制剂或化疗剂而言常常或必需进行不连续的或间歇性的给药，可以通过使用包含作为抗肿瘤活性成分的通式I的化合物的药物来免除这种不连续或间歇性的给药。仅仅由于本发明通式I的化合物具有良好的耐受性，所以这些物质连续的肠内或胃肠外给药是可能的。
通式I的化合物包含不对称碳原子，这些化合物所有的光学活性形式和外消旋混合物也是本发明的对象。
在本文中，特别感兴趣的是通式IIa和IIb的非对映异构体 其中R1、R2、n、R3、R4、R5和B表示与上面通式I中的基团相同的基团，并且这些化合物可以以其盐的形式被提供。
此外，本发明化合物的互变异构体以及其生理学上可耐受的无机或有机酸或碱的盐也是本发明所考虑的。这些物质还表现出选择的抗肿瘤或抗增生性。
本发明的另一个目的是其中R1表示具有10-14个C-原子的烷基链，和R2表示具有8-12个C-原子的烷基残基，n可以等于0、1或2，R4和R5表示氢，R3表示羟基，和B表示5-氟尿嘧啶残基的通式I的新物质以及其盐和所有的光学活性形式和对映异构体混合物。
特别优选的新物质是其中R1表示十二烷基残基，和R2表示癸基残基，n可以等于0、1或2，
R4和R5表示氢，R3表示羟基，和B表示5-氟尿嘧啶残基的通式I的化合物以及其盐和所有的光学活性形式和对映异构体混合物。
与迄今为止已知的化合物相比，该新物质在更低的剂量下可以表现出抗肿瘤或抗增生作用或者在体外或体内条件下具有更广的治疗谱。
本发明的化合物或其可药用的制剂还可以以与用于肿瘤疾病或瘤形成的预防和/或治疗、缓解或支撑治疗的其它适宜药物或其它活性成分的自由或固定组合的形式被使用。
这些另外的药物的实例包括例如用于预防和/或治疗瘤疾病的其它细胞抑制剂或化疗剂。这些物质包括例如芥子气的氮衍生物(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、曲磷胺、马磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑)、环乙亚胺和环氧化物(例如噻替派、曲他胺、三亚胺醌、曲奥舒凡)、烷基-烷烃-磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲类物质(例如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、福莫司汀、链脲霉素、氯脲菌素)、单官能和非经典的烷化剂(例如丙卡巴肼、达卡巴嗪、六甲蜜胺、米托唑胺、替莫唑胺、阿多来新以及其衍生物)、铂衍生物(例如顺铂、卡铂、奥马铂、奥沙利铂、tetraplatin、萘达铂、CI-973、DWA 2114R、JM 216、JM 335、顺式-和反式-铂衍生物)、叶酸-拮抗剂或抗叶酸剂(例如甲氨蝶呤、三甲曲沙、tomudex、依达曲沙、洛美曲索)、嘌呤和嘌呤核苷类似物(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司它丁)、嘧啶和嘧啶核苷类似物(例如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、喃氟啶、卡莫氟、替加氟、替加氟-gimestat-otastat、卡培他滨、依诺他滨、加洛他滨、去氧氟尿苷、阿糖胞苷[Ara-C]、阿轧胞苷[Aza-C]、CI-F-AraA、peldesine、吉西他滨及其衍生物)、蒽环类抗生素和相关的插入化合物(例如阿霉素以及其吗啉子基-衍生物、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星、氨柔比星、MX-2、米托蒽醌、洛索蒽醌、安吖啶、和pyrazoloacridine)、抗生素细胞抑制剂或化疗剂(例如博莱霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、clecarmycin、FK-317)、微管抑制剂例如长春花属生物碱(例如长春新碱[硫酸盐]、长春碱[硫酸盐]、长春地辛[硫酸盐]、长春瑞滨)、AM-132、KW-2170、rhizoxine、palmitoyl rhizoxine、dolostatins(例如dolostatin 10)、phomopsins、halichondrins、homohalichondrins、spongistatins、combrestatins、steganacine、紫杉烷类(taxanes)(例如紫杉醇、多西他赛、浆果赤霉素III以及它们的衍生物)、拓扑异构酶抑制剂，如例如表鬼臼毒素类(例如依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷)、J 1070088、TOP-53或喜树碱以及其类似物(例如9-氨基-喜树碱、托泊替堪、伊立替康、exatecane、CPT-11)、L-天冬酰胺酶、sparfosate、羟基脲、米托坦、埃博霉素(epothilone)和脱氧埃博霉素以及它们的衍生物、氟达拉滨、磷酸氟达拉滨、2-氯脱氧腺苷、2′-脱氧coformycin、高三尖杉酯碱、sumarin、抗肿瘤的-免疫抑制-作用药物，如例如环胞菌素、雷帕霉素(rapamycine)、脱氧链霉胺类和肾上腺皮质激素类(例如可的索、可的松、泼尼松、氢化泼尼松、对-、β-、地塞米松)。
本发明的化合物以及其药物制剂还可以以与下列物质的自由或固定组合的形式被用来用于预防和/或治疗肿瘤疾病或瘤形成酪氨酸激酶抑制剂(例如SU-5416、KT-8391、KT-5555)、法尼基转移酶抑制剂(例如BMS-214662、ER-51785、R 115777)、胸苷酸合酶抑制剂(例如2′-脱氧-2′-氟-4′-硫代阿糖胞嘧啶、雷替曲塞、TK-117、TAS 102、TAS103)、DNA聚合酶抑制剂(例如1-(2-脱氧-2-亚甲基-D-赤型-戊呋喃糖基)胞嘧啶[DMDC，Y-26436]、CS-682)、组蛋白脱酰基酶抑制剂(例如MS-275)、金属蛋白酶抑制剂(例如马立马司他、巴马司他、CGS-27023A、MMI-166、S-3304)、P-糖蛋白抑制剂(例如valspodar、MS-209、PAK-104P、LY-335979)、环氧加酶-2抑制剂(例如R-109339)、磷酸酶抑制剂、腺苷脱氨基酶抑制剂、RNA聚合酶抑制剂、蛋白激酶-C抑制剂(例如六癸基磷酸胆碱、calphostin、gossipol、槲皮素、非瑟酸、星形孢菌素[例如midostaurin、7-羟基星形孢菌素、KW-2401])、抗血管形成剂和血管形成的抑制剂(例如FMPA、TNP-470、抗-VEGF/VPF-单科隆抗体)或编程性细胞死亡的激动剂或诱导剂(例如AOP 99.0001、irofulvene、NCO-700、T 215、TAC-101)。
此外，本发明通式I的化合物还可以以与肿瘤学的预防和/或治疗中常用的激素或抗激素自由或固定组合地用于预防和/或治疗肿瘤疾病或瘤形成。这包括例如雄激素、雌激素、孕激素(gestagens)、抗雄激素、抗雌激素和抗孕激素以及抑制激素释放的抑制剂，如例如LHRH(促黄体激素释放激素)、其类似物、拮抗剂、和超拮抗剂。后面的化合物的实例包括布舍瑞林(醋酸盐)、戈舍瑞林(醋酸盐)、亮丙瑞林(醋酸盐)、曲普瑞林(醋酸盐)。LHRH拮抗剂的实例有antide、雷莫瑞克、西曲瑞克、替维瑞克、abarelix、和ORG 30850。
可以与本发明的化合物联用的激素激动剂的实例包括例如雌激素衍生物、磷雌酚、氯烯雌酚、炔雌醇、己烯雌酚、聚磷酸雌二醇、以及孕激素-类似物、醋酸甲羟孕酮醋、醋酸甲地孕酮和氟甲睾酮。
本发明通式I的化合物还可以与下列物质自由或固定组合地用于预防和/或治疗肿瘤疾病或瘤形成5α-还原酶抑制剂(例如依立雄胺、非那雄胺、妥罗雄脲、LV 654066)、甾体和非甾体类抗雄激素(例如醋酸环丙孕酮、氟他胺、BMOT、尼鲁米特[RU23908]、faslodex、卡地索[ICI 176334]、WIN 49596)、非甾体类抗雌激素(例如他昔莫芬、己烯雌酚、氯米芬、萘福昔定、MER-25、屈洛昔芬、托瑞米芬、秦哚昔芬、四甲基-HES、LY 117018)，本发明的化合物还可以与抗雌激素如例如ICI 164384、ZK 119010、ICI 182780、RU 58668联用。抗孕激素组合伴侣的实例有米非司酮(RU486)和奥那司酮(ZK98.299)。
用于本发明组合物的其它适宜的组合伴侣有芳酶抑制剂，如例如氨鲁米特、罗谷亚胺、来曲唑、以及甾类芳酶抑制剂如例如依西美坦、福美坦、米那美坦、阿他美坦、MDL 18962、ORG30958、和非甾类芳酶抑制剂，如例如法倔唑、伏氯唑、阿那曲唑、CGS-20267。
本发明通式I的化合物还可以与下列物质自由或固定组合地用于预防和/或治疗肿瘤疾病或瘤形成尿嘧啶、eniluracil、3′-乙炔基尿苷、3′-乙炔基胞苷、氟嘧啶(例如(E)-2′-脱氧-2′-(氟亚甲基)胞苷、MDL-101731)和/或二氢嘧啶脱氢酶(DPD)抑制剂，所说的肿瘤疾病或瘤形成如例如结肠直肠癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌或肺癌。
与本发明组合物自由或固定组合的特别适宜的组合伴侣是下面的氟嘧啶或氟嘧啶制剂·UFT，4∶1的固定摩尔比的尿嘧啶和替加氟(1-[2-四氢呋喃基]-5-氟尿嘧啶)的组合；·S-1(BMS 247617)，替加氟和两个5-氟尿嘧啶调节剂，即CDHP(氯-2，4-二羟基嘧啶，一种潜在的DPD抑制剂)以及钾oxonate的组合，·BOF-A2(乙嘧替氟)，一种由1-乙氧基甲基-5-氟尿嘧啶(EM-FU)和3-氰基-2，6-二羟基吡啶(CNDP)，一种潜在的DPD抑制剂所组成的药物，·Eniluracil(5-乙炔基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)，一种潜在的和不可逆的DPD抑制剂，·替加氟(1[2-四氢呋喃基]-5-氟尿嘧啶)·卡培他滨，依诺他滨或加洛他滨。
因为由于DPD的抑制而使得本发明化合物的抗肿瘤效力、耐受性、和稳定性显著增加，所以通过将本发明通式I的化合物与尿嘧啶、eniluracil、3′-乙炔基尿苷、3′-乙炔基胞苷、氟嘧啶或DPD抑制剂或调节剂如例如UFT、CDHP、CNDP等等联用可以获得另外的治疗益处。
本发明通式I的化合物还可以与细胞因子或细胞因子受体激动剂或拮抗剂自由或固定组合地用于预防和/或治疗肿瘤疾病或瘤形成。细胞因子组合伴侣包括例如白介素(例如白介素[IL]1-18[edodekin]，特别是IL1、2、3、6、10、11、12)、干扰素(例如干扰素α、β、γ)、肿瘤坏死因子(例如TNFα、β)、TNF激动剂(例如索纳明)以及转移生长因子(例如TGFα、β)。
造血生长因子也适用于本发明化合物的联合治疗。相关的实例包括例如红细胞生成素、血小板生成素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)。
由于其在具有十分良好的耐受性的情况下具有高抗肿瘤活性，所以本发明通式I的化合物适于与特异性或非特异性的主动或体液或细胞的被动免疫治疗行为相联合地用于预防和/或治疗肿瘤疾病和瘤形成。
特异性主动免疫疗法的实例包括例如注射或使用被照射的肿瘤细胞或肿瘤相关的抗原或具有基因改性的肿瘤细胞例如细胞因子基因转染子或使用病毒传染的肿瘤细胞的免疫法。在本文中，非特异性的主动免疫疗法包括例如使用免疫刺激或-调节物质，如例如BCG、iscador、Ok-432、左旋咪唑、乌苯美司、lentinam、贝他定、MER、MTP-PE。
其中可以用本发明通式I的化合物来预防和/或治疗肿瘤剂型和瘤形成的被动的体液免疫疗法包括例如注射或使用鼠科动物、人或人化的单克隆抗体或免疫轭合物，例如放射性同位素-、细胞抑制剂-或毒素-偶合的(抗毒素)单克隆抗体(例如gentuzumab、依决洛单抗、trastuzumab、rituximab、lintuzumab、ACA-11、V-10500、抗-HM1.24MAB、C225)。被动体液免疫的另外的实例包括基因改性的单克隆抗体、双特异性的抗体或免疫球蛋白-T-细胞-受体嵌合体。本发明通式I的化合物还可以与被动细胞免疫疗法自由或固定组合地联合用于预防和/或治疗肿瘤疾病和瘤形成。这种类型的治疗方法的实例包括例如采用使用细胞毒性效应器细胞如例如淋巴因子-活化的杀伤细胞(LAK)、粘连的LAK、大颗粒淋巴细胞(LGL)、天然的杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、树状细胞或细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)的免疫疗法以及基因改性的效应器细胞的转移(基因治疗，例如腺病毒的(adenoviral)-p53)。
当与放疗相结合时，本发明通式I的化合物也表现出有价值的药理学性质。由于其高抗肿瘤效力，所以其与放疗联合用于治疗肿瘤疾病和瘤形成时可以产生协同的抗肿瘤和抗增生作用。另一方面，已知的放疗对快速增殖的细胞如例如骨髓细胞或胃肠道的粘膜细胞的非特异性-细胞毒性副作用并不会随着本发明通式I的化合物与放疗的联用而增加，这是由于这些物质具有极佳的器官/组织耐受性，所以联合治疗的治疗范围被大大拓宽。
本发明用于预防和/或治疗肿瘤疾病和瘤形成的包含本发明通式I的化合物的药物可以以液体或固体形式通过肠内或胃肠外途径来进行应用。常用的适宜应用形式有如例如片剂、胶囊、包衣片、糖浆、溶液、喷雾剂或混悬液。优选地以包含注射液常用添加剂的水注射介质的形式来进行应用，所说的注射液常用添加剂如稳定剂、溶液调节剂、和缓冲剂。这种类型的添加剂包括例如酒石酸盐和枸橼酸盐缓冲剂、乙醇、螯合剂如乙二胺四乙酸以及其无毒的盐、用于调节粘度的高分子聚合物如液态聚氧化乙烯。用于注射液的液体载体物质必须是无菌的并且优选地被填充到小瓶中。固体载体物质包括例如淀粉、乳糖、甘露醇、甲基纤维素、滑石粉、高分散的硅酸(silica acids)、较高分子量的脂肪酸，如例如硬脂酸、明胶、琼脂、磷酸钙、硬脂酸镁、动物和植物脂肪、固体高分子聚合物如聚乙二醇等等。如果需要的话，用于口服应用的适宜制剂可包含矫味剂或甜味剂。
剂量取决于各种因素，如应用类型、种属、年龄或个体状态。本发明的化合物的应用剂量通常为每天每公斤体重0.1-100mg，优选地为每天每公斤体重0.2-80mg。优选地将该日剂量分成2-5次来进行应用，每次应用涉及将包含活性成分含量为0.5-500mg的1-2片片剂或小瓶进行给药。片剂可以以延迟释放制剂的形式被提供，该延迟释放的片剂将每天的应用次数降低到1-3次。该延迟释放片剂的活性成分含量可以为2-1000mg。还可以通过1-3次胃肠外应用或通过固定的输入来将活性成分进行给药，因此，通常每天5-1000mg的数量就足够了。
将式I的化合物与一种或几种另外的活性成分相结合时，活性成分可以以相同给药形式的固定组合例如片剂或小瓶的形式被提供，或者可以以一种或几种其它给药形式的形式被提供。例如，如果被联合的活性成分彼此不相容，例如由于在储存期间发生发应而不相容，则需要后一种形式。不言而喻的是，对于三种或更多活性成分的组合而言，这些活性成分可以被制造成以一种形似进行给药的固定组合的形式或者可以被制造行以自由组合形式被应用的两种或多种给药形式。
用下面的实施例来对本发明进行解释，其不会对本发明的范围构成限制。
实施例15-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质A)和3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶核苷-5′-磷酸-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质B)在MethA纤维肉瘤模型中的抗肿瘤活性在以前的试验中，已经在体内条件下用鼠科动物MethA纤维肉瘤模型对物质——5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质A)和3′-叠氮基-3′-脱氧胸腺嘧啶核苷-5′-磷酸-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质B)的抗肿瘤或抗增生效力和功效进行了试验。
使MethA纤维肉瘤细胞以腹水肿瘤的形式在雌性CB6F1小鼠(Charles River Laboratories，Sulzfeld，德国)腹膜(i.p.)内生长。在整个试验的持续期间，在23±1℃的室温，55±5％的相对湿度和各12小时的亮-暗循环的条件下，将动物放在位于层流条件下的macrolon笼子中。给小鼠喂食标准饮食(Ssniff-SpezialditenGmbH，Soest/Westfalen，德国)并使其随意饮水。在进行相关试验前，使动物对该条件习惯至少14天。对于用鼠科动物病毒进行的感染而言，对动物进行日常检查。
对了对活性物质进行试验，通过皮下(s.c.)途径以每只小鼠1×105个MethA纤维肉瘤细胞的数量对年龄为6-8周的雌性CB6F1小鼠进行接种。通过以每周一次的间隔如Hermann D.B.J.，Pahike W.，Opitz H.-G.和Bicker U.，Cancer Treatment Reviews，17,247-252，1990所描述的那样对两个垂直的肿瘤直径进行测量来有规律地对对照组小鼠和verum-治疗组动物的肿瘤生长进行测定。通过以剂量依赖的方式以在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中的形式一周一次地i.p.给药来对试验物质进行测试。用安慰剂(PBS)对对照组动物进行处理。
表1表示在体内条件下物质A和B对MethA纤维肉瘤模型中肿瘤生长的作用。将在接种肿瘤细胞后的21和28天时的肿瘤体积表示为每个实验组的10只动物的中值。
表1在MethA纤维肉瘤模型中的抗肿瘤活性剂量 肿瘤体积(mm3)a组物质(mg/kg/应用) 第21天 第28天1 对照(安慰剂b)-- 4.032(-) 9.827(-)2 物质A31.649*(59.1)4.163*(57.6)3 物质A30 416**(89.7) 1.254**(87.2)4 物质A100 357**(91.1) 762**(92.2)2 物质B33.998(0.8) 10.228(+4.1)3 物质B30 4.102(+1.7) 9.963(+1.4)4 物质B100 4.021(0.3) 10.098(+2.8)a中值；每组10只动物；相对于圆括号中的组1的对照值而言的抑制百分比(+表示增加)b安慰剂磷酸盐缓冲的盐水(PBS)*p≤0.05，**p≤0.01；Mann-Whitney检验结果表明本发明的物质A令人吃惊地显著抑制了肿瘤生长并且是以剂量-和时间-依赖的方式进行抑制的，即表现出抗肿瘤和抗增生性。
物质B(EP 545966的实施例1a)没有表现出抗肿瘤或抗增生性。
实施例25-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质A)在体内条件下的耐受性用雌性NMRI小鼠对物质A的耐受性进行试验。使动物位于与实施例1所描述的条件相同的条件下。
通过一种食管探针以1或1.5g/kg物质A的给药量对6-8周大的雌性NMRI小鼠(Charles River Laboratories，Sulzfeld，德国)进行处理。随后，测定下面的毒性参数
·血细胞计数，包括血细胞浓度(WBC)，血红细胞浓度(RBC)，血红蛋白(HB)，血细胞比容(HCT)，血小板浓度(PLT)，平均细胞体积(MCV)，平均细胞血红蛋白(MCH)和平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)，·骨髓细胞计数，即每股骨髓细胞的数目(M/股)，·体重，·器官重量，包括结肠、心、脑、小肠、肺、肝、胃、脾、肾、卵巢的重量。
这些试验的结果如表2所示。
表2在体内条件下5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯(物质A)的耐受性a对照 物质A 物质A参数(安慰剂b)(1g/kg) (1.5g/kg)骨髓细胞计数 28.28±0.99 28.48±0.86 31.44±1.51(M/股)血液水平WBC(k/μl) 12.20±0.66 14.34±2.18 16.97±6.05RBC(M/μl) 9.24±0.179.31±0.238.34±0.56HB(g/l)17.16±0.31 17.85±0.39 15.79±0.92HCT(％)46.54±0.97 47.93±1.16 43.42±2.77MCV(fl)50.32±0.51 51.50±0.58 52.09±0.81MCH(pg)18.62±0.14 19.28±0.22 19.09±0.37MCHC(g/dl) 36.91±0.36 37.29±0.44 36.53±0.38PLT(k/μl) 1115±48 1153±41 1431±172体重(g)29.7c28.7c27.9c器官重量结肠(g)429±17 373±15 392±29心 (g)130±3133±4126±9肺 (g)218±5226±9206±9肝 (g)1.597±53 1.602±42 1.739±81肾 (g)380±9361±17 351±26脾 (g)131±12 125±9204±26胃 (g)226±6232±7232±16小肠(g)1.494±73 1.622±61 1.807±112脑 (g)372±21 399±8387±18卵巢(g)197±18 183±17 203±33a均值±SEM；每组10只动物b安慰剂磷酸盐缓冲的盐水(PBS)c中值该数据表明，即使在十分高的剂量，即1或1.5g/kg体重的情况下，与用安慰剂(可饮用的水)处理的对照组相比，物质A也没有造成上面所列的耐受性参数的显著降低。这些结果证明，在体内条件下在即使很高的剂量下物质A也没有非特异性的毒性。甚至在十分高的剂量下物质A也没有显著的骨髓抑制、血毒性或非特异的器官不耐受毒性。
总之，实施例1和2的结果表明本发明通式I的化合物在体内条件下令人吃惊地具有十分良好的抗肿瘤或抗增生功效，而且其没有非特异性的毒性如骨髓抑制、血毒性或器官毒性。EP 545 966中所描述的结构与式I不符的其它化合物没有表现出这些药理学性质。
实施例35-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯的制备如在WO 95/32984中所述的那样，在室温下，将52g粗制的rac-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基-二氢磷酸盐和53.3g 2，4，6-三异丙基苯磺酰氯在600ml纯吡啶中在氩气下搅拌1小时。然后，向其中加入27.4g 3′-乙酰基-2′-脱氧-5-氟尿苷并将该混合物再搅拌16小时。
随后，向其中加入100ml水并将该混悬液搅拌10分钟。在真空下除去溶剂，将残余物用甲苯洗涤两次，每次使用200ml甲苯，将残余的粘性油状物混悬于700ml MTBE(甲基-叔-T基醚)中。在将其加热至40℃后，在超声浴中进行超声，然后将其冷却至20℃，将沉淀滤出并用100ml MTBE对其进行洗涤。
将滤液用150ml 2N的盐酸萃取三次，对有机相进行蒸发，然后将残余物溶解于400ml甲醇中。在加入42ml 30％的甲醇钠溶液(pH＝11)后，简单搅拌，向其中加入5ml冰醋酸，在真空下将低沸点的物质蒸馏掉。
将残余物溶解于700ml MTBE中并用2N的盐酸萃取两次，每次使用100ml盐酸。将有机相蒸发，用100ml甲苯对其重新蒸馏。
残余物包含游离酸形式的标题化合物。
实施例4
5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯，钙盐的制备在50℃下将前面反应的粗品溶解于1升丙酮中。通过在搅拌的条件下缓慢滴加30g位于75ml水中的醋酸钙并在1小时内使其冷却至室温来将使相应的钙盐沉淀。
将该沉淀吸出，用丙酮进行洗涤并将其在真空下进行干燥。收率106g钙盐粗品。
实施例55-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基酯的色谱纯化将得自前面反应的钙盐混悬于600ml MTBE和200ml 2N的盐酸中。然后将有机相分离出来并将其在真空下蒸发。收率67.4g。在40℃下将粗品溶解于140ml甲醇中，然后向其中加入36ml三乙胺和20ml水。
将该产物的等分试样用使用LiChroprep RP18，25-40μm(柱Ф50mm，长度为200mm)的制备HPLC进行纯化，用甲醇/0.04M醋酸钠溶液(80/20)作为洗脱剂。
然后将包含产物的级分合并并在真空下将其体积减至初始体积的30％。在搅拌的情况下，以各滴的形式向其中加入40ml水并将该混悬液再搅拌1小时。将沉淀吸出并将其在真空下进行干燥。收率42.2g该钙盐。
实施例65-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯，钠盐的制备将该42.2g钙盐全部混悬于400ml MTBE和200ml 2N的盐酸中。将有机相分离出来，用硅藻土进行过滤，然后将其在真空下进行蒸发。将残余物用甲苯再蒸馏两次，每次使用100ml甲苯，然后将其在40℃下溶解于80ml甲苯中。通过在搅拌下加入30％的甲醇钠溶液将pH调至7，然后在50℃下以各滴的形式将该溶液加入到1.4升丙酮中。
在搅拌1小时后，将沉淀吸出，用丙酮进行洗涤，然后将其在真空下进行干燥。收率41.2g，Fp175℃(分解)。
实施例75-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-[(2R)-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)]丙基酯的制备按照实施例3至6的操作，其可从(R)-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基-二氢磷酸盐开始来制备游离酸、钙盐或、钠盐形式的该轭合物——5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-[(2R)-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)]丙基酯。
通过参考被确认了的样品的薄层色谱来对该物质进行鉴定。
实施例85-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-[(2S)-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)]丙基酯的制备按照实施例3至6的操作，其可从(S)-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基-二氢磷酸盐开始来制备游离酸、钙盐、或钠盐形式的该轭合物——5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-[(2S)-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)]丙基酯。
通过参考被确认了的样品的薄层色谱来对该物质进行鉴定。
通过用非对映异构的盐进行的外消旋体的分离来制备对映异构纯的(R)-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基-二氢磷酸盐或(S)-(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基-二氢磷酸盐。
实施例95-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-[2-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)]丙基酯与顺铂、阿霉素、长春新碱、和喜树碱的组合对包含物质A和顺铂、阿霉素、长春新碱和喜树碱的组合在增生实验中的作用进行了测试。对于这一目的而言，将物质A以1mg/ml的存储浓度溶解于介质中。将其它物质以1mg/ml的相同存储浓度溶解于水或DMSO(二甲基亚砜)中。在96-孔板中进行系列实验。对于各滴定系列而言，将75μl该物质的溶液放置在第一个孔中，然后将25μl各物质转移到下一行中或者将100μl放置在第一个孔中并将50μl各物质转移到下一列中。然后向其中各加入50μl的细胞混悬液(5×104个细胞/ml，K562细胞，RPMI 1640介质)，然后将该板在37℃下在5％的CO2和95％的湿度下培养24至78小时。用不存在物质和纯介质的细胞作为对照。
用以四唑鎓盐——WST-1(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，DE)的裂解为基础的比色法来测定试验物质的体外活性。对于此目的而言，将培养物用10μl WST培养4小时。然后将该板轻轻振摇。用ELISA读数器(Spectra MAX340pc，MolecularDevices，Ismaning，DE)在440至650nm的波长下对光密度进行测量。
测定各物质的IC50值。在组合的情况中，以恰好不表现出抗增生作用的浓度使用其中的一种物质，然后在加入第二种物质后对该组合的IC50值进行测定。
与顺铂的组合产生的物质A和顺铂的IC50值的降低分别为25％和50％。
与阿霉素的组合产生的物质A和阿霉素的IC50值的降低分别为约30％和约50％。
与长春新碱的组合产生的物质A和长春新碱的IC50值的降低分别为约60％和约65％。
与喜树碱在组合产生的物质A和喜树碱的IC50值的降低分别为约40％和约90％。
从这些实验可以清楚地看出，通过将这些物质相结合可以获得功效的协同增强。
实施例10
(5-氟尿苷)-5′-磷酸(3-十二烷基亚硫酰基-2-癸氧基)丙基酯将5g(5-氟尿苷)-5′-磷酸(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基酯混悬于50ml冰醋酸中，然后向其中加入30％的过氧化氢，然后将该混合物在室温下搅拌4小时。然后，用旋转蒸发器除去溶剂，用使用甲醇/0.1M的醋酸盐缓冲剂作为洗脱剂的使用RP 18的制备柱色谱法对残余物进行纯化。
将包含产品的馏分进行蒸发，然后将残余物在丙酮中进行搅拌，吸取沉淀。在将其在真空干燥箱中在40℃下进行干燥后，分离出总重为4.5g的亚砜。
熔点214-216℃(分解)，Rf＝0,27(BuOAc/iPrOH/H2O/NH4OH3/5/1/1)，31P-NMRδ＝0.027ppm实施例11(5-氟尿苷)-5′-磷酸(3-十二烷基磺酰基-2-癸氧基)丙基酯将一共10g(5-氟尿苷)-5′-磷酸(3-十二烷基硫代-2-癸氧基)丙基酯混悬于100ml冰醋酸中，然后向其中加入25ml 30％过氧化氢并将该混合物在50℃下搅拌6小时。然后再向其中加入13ml过氧化氢，然后将该混合物再搅拌7小时。
随后，用旋转蒸发器除去溶剂，用使用甲醇/0.1M的醋酸盐缓冲剂作为洗脱剂的使用RP 18的制备柱色谱法对残余物进行纯化。
将包含产品的馏分进行蒸发，然后将残余物在丙酮中进行搅拌，吸取沉淀。在将其在真空干燥箱中在40℃下进行干燥后，分离出总重为8.5g的亚砜。
熔点204-207℃(分解)，Rf＝0,29(BuOAc/iPrOH/H2O/NH4OH 3/5/1/1)，31P-NMRδ＝0.073ppm实施例12片剂将1.50kg5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯，钙盐1.42kg微晶纤维素1.84kg乳糖0.04kg聚乙烯吡咯烷酮0.20kg硬脂酸镁以干物质的形式进行混合，然后用水进行湿法制粒，干燥，然后用旋转压片机将其加工成500mg重的片剂。
实施例13注射液将10.0g 5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)丙基酯，钠盐溶解于500ml盐水中，然后将其过滤到5ml的各小瓶中，并将其灭菌。该溶液可以通过静脉注射来进行应用。
权利要求
1.通式I的化合物 其中R1表示具有10-14个碳原子的烷基链，R2表示具有8-12个碳原子的烷基链，n表示等于0、1或2的整数，R3表示羟基，R4和R5表示氢，和B表示5-氟尿嘧啶，其在给药于人后，直接或间接提供相应通式I的磷脂衍生物或其具有抗肿瘤或抗增生活性的其它代谢物或残基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1表示十二烷基残基和R2表示癸基残基。
3. 5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-磷酸-(3-十二烷基-硫代-2-癸氧基)-丙基酯以及其盐、立体异构体或互变异构体以及所有的光学活性形式和对映异构体混合物。
4.通式IIa或IIb的化合物以及其盐， 其中R1表示十二烷基残基和R2表示癸基残基，n表示0、1或2，R4和R5表示氢，R3表示羟基和B表示5-氟尿嘧啶残基。
5.如权利要求1至4所述的化合物用于肿瘤疾病或瘤形成的预防和/或治愈、缓解或支撑治疗。
6.如权利要求5所述的应用，其中所说的肿瘤疾病或瘤形成是癌，特别是结肠直肠癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌或胰腺癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病。
7.用于预防和/或治疗肿瘤疾病或血液学瘤形成的包含作为活性成分的通式I的化合物或其生理学可耐受的盐、立体异构体或互变异构体的药物， 其中R1表示具有10-14个碳原子的烷基链，R2表示具有8-12个碳原子的烷基链，n表示等于0、1或2的整数，R3表示羟基，R4和R5表示氢，和B表示5-氟尿嘧啶残基。
8.如权利要求7所述的药物，其中R1表示C10-C14直链烷基。
9.如权利要求7或8所述的药物，其中R1表示癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基或十四烷基。
10.如权利要求7至9中任意一项所述的药物，其中R2表示具有直链的C8-C12烷基。
11.如权利要求10所述的药物，其中R2表示辛基、壬基、癸基、十一烷基或十二烷基。
12.如权利要求7所述的药物，其中R1表示十一烷基或十二烷基和R2表示癸基或十一烷基。
13.如权利要求7至12中任意一项所述的药物，其中n等于0或1。
14.如权利要求7至13中任意一项所述的药物，其特征在于其包含一种或一些另外的用于肿瘤疾病或瘤形成的预防和/或治疗、缓解或支撑治疗的活性成分，如果需要的话其可以为两个或多个独立的给药形式。
15.如权利要求14所述的药物，其特征在于所说的另外的活性成分或活性成分们选自·芥子气的氮衍生物，例如环磷酰胺·环乙亚胺或环氧化物，例如噻替派·烷基烷烃磺酸盐，例如白消安·亚硝基脲化合物，例如卡莫司汀·单功能或非典型的烷化剂，例如丙卡巴肼、阿多来新·铂衍生物，例如顺铂、卡铂·叶酸拮抗剂或抗叶酸剂，例如甲氨蝶呤·嘌呤或嘌呤核苷-类似物，例如6-巯基嘌呤、喷司它丁·嘧啶或嘧啶核苷类似物，例如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨、替加氟、卡莫氟、喃氟啶·蒽环类抗生素或化学相关的嵌入化合物，例如阿霉素或其马啉子基衍生物、MX-2·抗生素细胞抑制剂或化疗剂，例如博莱霉素·微管抑制剂(例如长春花属生物碱、紫杉烷)、拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼毒素类)、磷酸酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、胸苷酸合酶抑制剂、DNA或RNA聚合酶抑制剂、组蛋白脱酰基酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂(例如马立马司他)、蛋白激酶C抑制剂(例如星形孢菌素)、P糖蛋抑制剂白、环氧加酶-2抑制剂、腺苷脱氨基酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂或血管形成抑制剂·细胞凋亡激动剂或诱导剂(例如AOP 99.0001)·肾上腺皮质激素，例如可的松、泼尼松。
16.如权利要求14所述的药物，其特征在于所说的另外的活性成分或活性成分们例如选自激素类物质(例如雄激素、雌激素、孕激素)；抗激素(例如抗雄激素、抗雌激素[例如他昔莫芬、托瑞米芬]、抗孕激素)；释放激素的抑制剂、其类似物、拮抗剂或超拮抗剂(例如布舍瑞林，亮丙瑞林)；芳香酶(例如氨鲁米特)；或5α还原酶抑制剂。
17.如权利要求14所述的药物，其特征在于所说的另外的活性成分或活性成分们选自尿嘧啶、3′-乙炔基尿苷、3′-乙炔基胞苷、替加氟(1-[2-四氢呋喃基]-5-氟尿嘧啶)、氟嘧啶、二氢嘧啶脱氢酶(DPD)抑制剂(例如氯-2，4-二羟基嘧啶、3-氰基-2，6-二羟基-嘧啶、5-乙炔基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)。
18.如权利要求14所述的药物，其特征在于所说的另外的活性成分或活性成分们选自下面的二氢嘧啶脱氢酶(DPD)抑制剂们或抑制剂制剂·UFT，一种固定摩尔比为4∶1的尿嘧啶和替加氟(1-[2-四氢呋喃基]-5-氟尿嘧啶)的组合；·S-1(BMS 247617)，一种替加氟和两个5-氟尿嘧啶调节剂、CDHP(氯-2，4-二羟基嘧啶，一种有效的DPD抑制剂)和potassiumoxonate的组合，·BOF-A2(乙嘧替氟)，一种由1-乙氧基甲基-5-氟尿嘧啶(EM-FU)和3-氰基-2，6-二羟基嘧啶(CNDP)——一种有效的DPD抑制剂的组合，·Eniluracil(5-乙炔基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮)，一种有效的不可逆的DPD抑制剂，·替加氟(1-[2四氢呋喃基]-5-氟尿嘧啶。
19.如权利要求14所述的药物，其特征在于所说的另外的活性成分或活性成分们选自细胞因子如例如白介素、干扰素、肿瘤坏死因子或转化生长因子。
20.如权利要求14所述的药物，其特征在于其中所说的另外的活性成分或活性成分们选自选自造血生长因子如例如红细胞生成素、血小板生成素、粒细胞集落-刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)。
21.如权利要求7至13中任意一项所述的药物，其特征在于指的是将用于特异性免疫疗法(例如使用被辐射的肿瘤细胞、与肿瘤有关的抗原、病毒感染或基因改性的肿瘤细胞[例如细胞因子基因转染剂])或用于非特异的免疫疗法(例如使用免疫刺激或调剂剂(例如BCG、iscador、左旋咪唑、乌苯美司、贝他定、Ok-432)、或者用于被动的激素免疫疗法(例如使用鼠科动物、人或人化的或双特异性的单克隆抗体，[例如C225]、免疫轭合物[例如放射性同位素-、细胞抑制剂-或毒素-偶合的单克隆抗体或抗毒素]、免疫球蛋白T-细胞嵌合体)或用于细胞的免疫疗法(例如采用的使用细胞毒性效应器细胞[例如淋巴因子-活化的或天然的杀伤细胞、肿瘤-浸润淋巴细胞、细胞毒性的T-淋巴细胞]的免疫疗法、基因改性的效应器细胞的转移[基因治疗])的方法与式I的化合物联用。
22.用于对肿瘤进行治疗的方法，其特征在于使用至少一种如权利要求7至13中任意一项所述的药物。
23.如权利要求22所述的方法，其中将所说的药物与特异或非特异性的、主动的或与体液或细胞的被动的免疫疗法行为相联合。
24.如权利要求23所述的方法，其中所说的特异性的主动免疫疗法选自注射或应用被照射的肿瘤细胞或肿瘤相关的抗原或使用基因改性的肿瘤细胞，例如使用细胞因子基因转染剂、或使用病毒感染的肿瘤细胞的免疫法。
25.如权利要求23所述的方法，其中所说的非特异性的主动免疫疗法选自使用免疫刺激或调节物质，如例如BCG、iscador、Ok-432、左旋咪唑、乌苯美司、lentinam、贝他定、MER、MTP-PE。
26.如权利要求23所述的方法，其中所说的被动体液疗法选自注射或应用鼠科动物、人或人化单克隆抗体或免疫轭合物，例如放射性同位素-、细胞抑制剂-或毒素-偶合(抗毒素)的单克隆抗体(例如gentuzumab、依决洛单抗、trastuzumab、rituximab、lintuzumab、ACA-11、V-10500、抗-HM1.24MAB、C225)或基因该性的单克隆抗体、双特异的抗体或免疫球蛋白-T-细胞受体嵌合体。
27.如权利要求23所述的方法，其中所说的被动细胞免疫疗法选自采用使用毒性效应器细胞，如例如淋巴因子-活化的杀伤细胞(LAK)、粘连的LAK、大颗粒淋巴细胞(LGL)、天然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)、树状细胞或细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL)以及基因改性的效应器细胞的免疫法(基因治疗，例如adenoviral-p53)。
28.如权利要求22所述的方法，其中将所说的药物与放疗联用。
全文摘要
本发明涉及包含磷脂衍生物，优选地为通式(I)的非天然核苷的药物，其中R
文档编号C07H19/10GK1615314SQ02827219
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月18日 优先权日2001年11月21日
发明者D·赫曼恩 申请人:海德堡医药有限责任公司