释法克隆化，最终建立得 到一株稳定的分泌且能够检测孕酮的单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人将该杂交瘤细胞株 命名为杂交瘤细胞株LX20150930,于2015年9月30日送交中国.武汉.武汉大学中国典 型培养物保藏中（CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCN0:C2015170。
[0034] 2.孕酮单克隆抗体的制备与纯化：用RPMI1640基础培养基（购自Hyclone公司） 悬浮培养由保藏编号为CCTCCC2015170的杂交瘤细胞株LX20150930扩大培养的细胞，在 接种前7天取Balb/c小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心）4只，每只小鼠腹腔注射0. 5mL 弗氏不完全佐剂进行预处理，待小鼠腹腔明显膨大时采集腹水，收集的腹水在5000r/min 离心lOmin后，去掉表面油层，小心吸取上清，分装后置-20°C保存备用。对提取的腹水进 行预处理：与等体积的巴比妥缓冲液（取巴比妥钠4. 42g，加水使溶解并定容至400ml， 用2mol/L盐酸溶液调节pH值至7. 4,滤过，即得）混合，加入适量的二氧化硅，室温搅拌 30min，静置5分钟，3000r/min，离心lOmin，得澄清腹水。取预处理后的腹水加2倍体积的 0. 06mol/L的醋酸缓冲液（0. 02mol/L的醋酸缓冲液稀释来的。0. 02mol/L的醋酸缓冲液的 制备：称取1. 6406克无水乙酸钠，用水溶解后，用水稀释至约960ml，然后用冰乙酸调溶液 pH值至5. 0，再定容至1000ml)，用盐酸调节pH至4. 5,充分搅拌下在30min钟内。每毫升 (按原腹水体积计算）30ul的辛酸缓慢加入，4°C静置2h，取出，然后在4°C，15000r/min，离 心30min，弃沉淀。用饱和硫酸铵（500g硫酸铵加入500ml的蒸馏水中，加热至完全溶解，室 温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/LNaOH调pH至7. 8)沉淀 单抗，上清液经滤膜过滤，再加入1/10体积的0. 1M磷酸缓冲液（准确称取10. 86gNa2HP04 和6. 08gNaH2P04，加入双蒸水充分稀释后定容至lOOOmL)，用氢氧化钠调节pH至7. 6,冰 浴搅拌下加入硫酸铵至终浓度为〇. 277g/mL，于4°C静置后离心，沉淀用磷酸盐缓冲液（准 确称取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04,0 . 24gΚΗ2Ρ04，加入双蒸水使之溶解，并定容至 lOOOmL)重悬，透析。将透析完全的抗体于4°C，5000r/min离心30min，利用紫外吸收法测 定蛋白质浓度。用SDS-PAGE电泳鉴定纯化后抗体的纯度，结果表明该单克隆抗体可用于标 记胶体金。
[0035] 实施例2金标抗体相关溶液的制备
[0036] 1、各种溶液的配制：
[0037] (1)柠檬酸三钠溶液的配制：准确称取0.5697g柠檬酸三钠，用超纯水溶解，并定 容至50mL。4°C保存备用。
[0038] (2)氯金酸溶液的配制：取lg固体氯金酸用超纯水溶解，并定容至100mL。4°C保 存备用。
[0039] (3)碳酸钾溶液的配制：0· 01m〇l/L，准确称取1. 38gK2C03,用超纯水水溶解，并定 容至100mL。4°C保存备用。
[0040] (4)磷酸盐缓冲液（PBS)的配制：准确称取1. 00g牛血清白蛋白（BSA)溶于少量 0.OIMpH7. 2PB溶液中，用双蒸去离子水定容至100mL。
[0041] (5)10%牛血清白蛋白出3厶）溶液的配制：准确称取83厶1.0(^溶于101^0.021 pH7. 2PB溶液中，用0. 22μm的膜过滤，现配现用。
[0042] 2、氯金酸溶液的制备与纯化
[0043] 将1ml氯金酸溶液加入到99ml的三蒸水中，加热至100°C，然后迅速向其中加入 lmll%的柠檬酸三钠溶液，继续加热，当溶液变为酒红色时取下金溶液，再搅拌10分钟至 溶液冷却，用超纯水将溶液定容至原体积，放4°C备用。
[0044] 溶液质量鉴定：肉眼观察法，观察颜色是否有变化，是否有浑浊出现，是否有凝胶 形成。
[0045] 3、金标抗体溶液的制备
[0046] (1)最适孕酮抗体量的确定
[0047] 用0. 2mol/L的碳酸钾溶液将胶体金溶液调至pH值为8. 2,取胶体金溶液1ml分别 加入8个小试管中。将本发明制备的孕酮单克隆抗体逐级稀释后，取等体积单抗稀释液按 顺序分别加入上述试管中，设一管不加抗体的对照管，具体设计如表1所示。放置10分钟 后，在各试管中加入10%氯化钠溶液0.lml，混匀后静置。观察各试管中胶体金溶液变化， 未加抗体及加入量不足的溶液颜色由红色变蓝色，而加入抗体量达到或超过饱和量的溶液 则保持不变。标记抗体量为在最低稳定胶体金溶液不变色的抗体量基础上再加20 %抗体 量。
[0048] 表1胶体金标记孕酮单克隆抗体的最适稳定浓度的确定
[0049]
[0050] ⑵最适pH的确定
[0051] 采用pH梯度法。取9个离心管各加入1ml胶体金溶液，各管依次调节pH(见表 2)，在各管中加入最适抗体的量，混匀，室温静置15分钟。用紫外分光光度计测定521nm波 长处的吸光值。
[0052] 表2胶体金标记孕酮单克隆抗体的最适标记pH的确定
[0053]
[0054] (3)金标抗体溶液的制备
[0055] 1)调节pH:首先将氯金酸溶液放在磁力搅拌器上，调节温度和速率，用0.lmol/L 的碳酸钾溶液调节pH，搅拌均匀，一般20ml的金溶液需加入200ul的碳酸钾溶液；
[0056] 2)将孕酮单克隆抗体（简称单抗）用三蒸水稀释10倍，然后缓慢的加入到金溶液 中，搅勾30min;
[0057] 3)加入1 %的牛血清白蛋白（BSA)溶液搅拌5min;
[0058] 4)再加入 0· 605ml的PEG-2000，搅拌 30min;
[0059] (4)金标抗体复合物的纯化
[0060] 1)将金标溶液分装到1. 5mL离心管中，12000r/min离心30min，去上清。
[0061] 2)加入硼酸至原始体积，4°C静置30min，4°C、12000r/min离心30min，去上清。
[0062] 3)加入lmL硼酸，4°C、12000r/min离心 30min，去上清。
[0063] 4)加入lmL硼酸，4°C、4000r/min离心20min，浓缩溶液至lmL，4°C保存备用。
[0064] 实施例3孕酮胶体金免疫层析试纸条的制备
[0065] 1.包被抗原稀释液及浓度的确定
[0066] (1)最佳稀释液的确定：
[0067] 各种稀释液的配制：
[0068] a. 0· 01mol/L 的 TBS溶液，pH = 7. 6
[0069] b. 0· 01mol/L 的 TBS溶液，pH = 9. 0
[0070] c. 0·01mol/L 的 PBS溶液，pH = 7· 6
[0071] d. 0·Olmol/L的碳酸盐缓冲液溶液，pH= 9· 0
[0072]e.双蒸水
[0073] 将包被抗原（孕酮-0VA，购自上海药巢生物工程有限公司）用上述五种溶液分别 稀释为〇· 2mg/ml、0. 6mg/ml、l. 0mg/ml、l. 4mg/ml，然后用点膜仪将抗原包被于试纸条上，干 燥后滴加金标抗体，观察结果，确定最佳稀释液。
[0074] (2)包被抗原浓度的确定
[0075] 用最佳稀释液将抗原稀释为 0. 2mg/ml、0. 6mg/ml、0. 8mg/ml、1.Omg/ml、1. 2mg/ml、 1.4mg/ml，将不同浓度的包被抗原点在试纸条上作为检测线，然后用其检测阴性样品，观察 试纸条显色结果，从而确定最佳包被抗原的浓度。