残基 侧链的脱酰胺化（其中，发生了稳定同位素氧的引入）。该含候补糖肽的候补糖蛋白质的鉴 定是通过检索软件Mascot进行。
[0095] (4)糖链结合位置的鉴定
[0096] 将通过MS/MS离子检索法鉴定的候补糖肽中的、在天冬酰胺残基侧链发生了脱酰 胺化（稳定同位素的引入）且含N键型糖基化的共有序列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、其中Xaa不 为Pro)的候补糖肽，作为本实施方式的糖蛋白质片段。并且，将所得糖蛋白质片段的共有 序列中的天冬酰胺残基作为糖链结合部位。应于说明，Xaa为Lys/Arg，所鉴定的肽序列在 该位置被切除的情况下，参照其蛋白质全体的氨基酸序列，Xaa之后的残基为[Ser/Thr]， 则将该候补糖肽也包括于糖蛋白质片段。原则上共有序列为糖链结合位置，但也有报道不 与其相关的部位。本申请中，可通过肽-N-聚糖酶（糖肽酶F、PNGase)处理鉴定切除的糖 链结合位置。
[0097] 通过上述方法选择的肺癌鉴定标志物糖蛋白质片段群及根据其氨基酸序列鉴定 了的含其片段的肺癌鉴定标志物糖蛋白质为表1以及表2所示的糖蛋白质片段群以及糖蛋 白质。
[0098] 对于上述糖蛋白质片段群以及糖蛋白质，通过使用识别其的凝集素或抗体，例如 验证被检测者的血清中是否存在，从而可成为判定该被检测者是否患有肺癌的肺癌鉴定标 志物。
[0099] 1 一 3 - 3.肺癌鉴定标志物的验证
[0100]关于在上述1一3-2的项中缩小范围的肺癌鉴定标志物，可进一步验证其有意 性。例如，可将从肺癌培养细胞上清中用探针凝集素进行捕集的糖蛋白质和/或糖蛋白质 片段，使用特异性识别上述分离?鉴定的肺癌鉴定标志物的抗体，通过免疫印迹或免疫沉降 来进行检测、确认。本说明书中，表1所示的31种肺癌鉴定标志物糖蛋白质及其糖蛋白质 片段属于通过上述抗体检测而进一步选择的肺癌鉴定标志物。
[0101] 另外，可进一步验证通过上述抗体检测而选择的肺癌鉴定标志物。例如，可从肺癌 患者的血清中使用探针凝集素进行捕集，使用上述特异性抗体进行检测。作为一例，图5所 示的表1所述的神经细胞粘附分子（NCAM1)(表1中的蛋白质#19)以及纤粘连蛋白1 (表1 中的蛋白质#8)、以及图6和8所示的分泌颗粒素III(表1中的蛋白质#23)，是通过该进 一步的验证而其有用性得到了确认的肺癌鉴定标志物糖蛋白质。在此，神经细胞粘附分子， 如表1所示，仅在肺小细胞癌中与AAL凝集素结合，所以可成为鉴定肺小细胞癌的肺癌鉴定 标志物。另外，分泌颗粒素ΠI，如表1所示，仅在肺小细胞癌中与AAL凝集素和ConA凝集 素结合，所以可成为鉴定肺小细胞癌的肺癌鉴定标志物。另一方面，纤粘连蛋白1，如表1所 示，仅在肺腺癌中与AAL凝集素结合，所以可成为鉴定肺腺癌的肺癌鉴定标志物。或者，例 如可以从肺癌细胞株的培养上清中使用上述特异性抗体进行捕集，使用凝集素阵列进行检 测。作为一例，图9所示的表1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-LI(IGFBP-L1)(表1中 的蛋白质#12)、图10所示的表1所述的纤粘连蛋白1(表1中的蛋白质#8)属于通过该进 一步的验证其有用性得到了确认的肺癌鉴定标志物糖蛋白质。在此，胰岛素样生长因子结 合蛋白-LI(IGFBP-L1)，如图9所示，在肺小细胞癌中能检测强烈的PWM凝集素点上的荧光 信号，所以可成为鉴定肺小细胞癌的肺癌鉴定标志物。另一方面，纤粘连蛋白1，如图10所 示，仅在肺腺癌中能检测PNA凝集素点上的荧光信号，所以可成为鉴定肺腺癌的肺癌鉴定 标志物。
[0102] 1 - 4.肺癌鉴定标志物糖肽以及糖蛋白质的检测
[0103] 1 - 4-1.质谱法
[0104] 关于肺癌鉴定标志物糖肽以及糖蛋白质，可对利用与糖链结合的探针凝集素等进 行捕集的试样，将质谱仪作为检测器来进行检测。
[0105] 肺癌鉴定标志物糖肽的检测，优选将捕集的糖肽的糖链切除处理后通过液相色谱 法（LC)进行分离，将洗脱的肽依次直接在线导入质谱仪（MS)进行检测。质谱的收集，除了 单纯地获取质谱之外，还可以获取利用了碰撞诱导解离（CID)等解离法的MS/MS谱，进而仅 在检测预先选择的离子的情况下通过CID等进行解离，检测所生成的多个碎片离子（被称 为质谱单反应监测或者质谱多反应监测的方法）。另外还可以向分析试样添加合成肺癌鉴 定标志物糖肽的核心肽部分后向其一部分引入稳定同位素而生成质量差的对象肽，比较各 自的信号强度而进行相对或者绝对定量分析。也可以简单地将检测的粒子信号强度在多个 试样之间或者与标准试样进行比较，进行简单的定量。
[0106] 肺癌鉴定标志物糖蛋白质的检测，可使用各种各样的公知的蛋白质组学的方法。 例如，可将捕集到的蛋白质用一次元或者二次元的凝胶电泳进行分离，将目标点的检测强 度（染色、荧光等）与标准试样进行比较，进行定量。作为利用了质谱仪的检测法，可以将 捕集到的蛋白质群用蛋白酶消化，将所生成的肽用LC/MS法进行分析检测。定量时可并用 利用稳定同位素标记的各种方法（ICAT、MCAT、iTRAQ、SILAC法等）或非标记的简单定量法 (肽计数法、面积积算法等）。而且如后述也可以通过ELISA法进行定量。
[0107] 1-4一2.凝集素微阵列
[0108] (1)利用凝集素微阵列的糖链分布
[0109] (a)凝集素微阵列（也简单地称为凝集素阵列）
[0110] 凝集素阵列是作为糖链探针将多种特异性不同的凝集素在一个基板上并列固定 (阵列化）而成的，能够同时解析出对分析对象复合糖质何种凝集素以何程度进行相互作 用的。通过使用凝集素阵列，能将糖链结构推定所必要的信息以一次性分析获取，并且，能 将试样制备到扫描为止的操作工序迅速且简单地实现。质谱等的糖链分布系统中，无法 将糖蛋白质直接进行分析，必须预先处理成糖肽、游离糖链的状态。另一方面，在凝集素 微阵列中，例如具有仅通过向核心蛋白质部分直接导入荧光体就能直接进行分析的优点。 凝集素微阵列技术是本发明人等开发的，其原理、基础，例如记载于KunoA.，etal.Nat. Methods2,851-856(2005)。
[0111] 作为在凝集素阵列中使用的代表性的凝集素，例如可举出下表3所述的凝集素。
[0112] [表 3]
[0113]
[0114」 例如，将包拈上还43柙凝集系的45柙的凝集系在.蓝上回足化的凝集系阵列（GP BIOSCIENCESLTD.制LecChip)已可从商用途径获得。
[0115] (2)利用凝集素阵列的糖链分布的统计解析
[0116] 凝集素阵列现在已发展到了不仅对精制标品，对血清、细胞裂解物等的混合试样 也能进行定量比较糖链分布（比較糖鎖7° 口 7 7 4卩 > 夕）的实用化技术。尤其细胞表 层糖链的比较糖链分布的发展非常惊人（Ebe，Y.etal.J.Biochem. 139, 323-327 (2006)、 Pilobello，K.T.etal.ProcNatlAcadSciUSA. 104, 11534-11539 (2007)、Tateno，H.et al.Glycobiology17, 1138-1146(2007))〇
[0117] 另外，关于利用糖链分布的统计解析的数据挖掘，例如可通过"KunoA，et al·JProteomicsBioinform· 1，68-72 (2008) · "、或者"日本糖质学会 2008/8/18 凝集 素微阵列应用技术开发~生物体试样的比较糖链分布与统计解析~久野敦、松田厚志、 板仓阳子、松崎英树、成松久、平林淳"以及"MatsudaA，etal.BiochemBiophysRes Commun. 370, 259-263(2008). "所公开的方法进行。
[0118] (3)抗体覆盖?凝集素微阵列法
[0119] 凝集素微阵列的平台基本如上述，在检测时，不是对上述被检测者的试样直 接用荧光等进行标记，而是介由抗体间接地将荧光基等导入到被检测者的试样，从而 能同时对多试样进行简单、高速化的分析的应用法（可参照"KunoA，KatoY，Matsuda A,KanekoMK,ItoH,AmanoK,ChibaY,NarimatsuH,HirabayashiJ.MolCell Proteomics. 8, 99-108 (2009) "、"平林淳、久野敦、内山升"使用凝集素微阵列的糖链分布应 用技术的开发"、实验医学增刊"从分子水平出发的癌诊断研究~临床应用的探讨~"、羊土 社、V〇125(17) 164-171 (2007)"、久野敦、平林淳"利用凝集素微阵列的糖链分布系统的糖链 生物标志物探索当中的应用"、基因医学M00K11号"临床糖链生物标志物的开发与糖链功 能的解明"、PP·34-39、medicaldo(2008))〇
[0120] 例如，糖蛋白质为被检测者的试样时，糖链部分被凝集素微阵列上的凝集素识别， 所以通过将对核心蛋白质部分的抗体从其上覆盖（overlay)而不进行标记被检测糖蛋白 质或者不进行高度精制就能特定地以高灵敏度进行检测。
[0121 ] (4)凝集素覆盖·抗体微阵列法
[0122] 是代替凝集素微阵列，使用将对核心蛋白质的抗体在玻璃基板等的基板上并列固 定（阵列化）的抗体微阵列的方法。需要仅相对于所要调查的标志物的数量的抗体。需要 预先确定检测糖链变化的凝集素。
[0123] 1 一 4 一 3凝集素-抗体夹心免疫学检测
[0124] 可以基于凝集素阵列的结果设计简便且廉价的夹心检测法。基本上将使用2种 抗体的夹心检测法中使用的标准法中的一个抗体替换为凝集素就可应用。因此，该方法可 应用于使用现有自动免疫检测装置的自动化检测。唯一需要考虑的点是用于夹心的抗体 和凝集素之间的反应。抗体至少具有2个N键型糖链。因此，所使用的凝集素识别抗体 上的糖链时，夹心检测时将会出现因该结合反应引起的背景噪声。为抑制该噪声信号的 发生可考虑在抗体上的糖链部分导入修饰的方法或仅使用不含糖链部分的Fab的方法， 这些可使用公知的方法。作为向糖链部分导入修饰的方法，例如可举出ChenS等的Nat Methods. 4, 437-44 (2007)、ComunaleΜΑ等的JProteomeRes. 8, 595-602 (2009)等，作为 使用Fab的方法例如可举出MatsumotoH等的ClinChemLabMed48,505-512(2010)等。
[0125] 1 - 4 一 4.使用连续色谱法的方法
[0126] 抗体覆盖·凝集素阵列是统计学地发现最能反映肺癌鉴定标志物糖蛋白质上的疾 病特异性糖链变化的凝集素的最好的方法。另一方面，需要能够免疫沉降和覆盖检测的抗 体。然而，未必能获得这样的抗体。因此，作为能将更多的候补分子利用于检测肺癌的方法， 通常对用探针凝集素进行捕集的糖蛋白质进行目标糖蛋白质的免疫学定量检测。具体而 言，进行SDS-PAGE，膜转印后，通过免疫印迹进行免疫学检测。通过比较所得条带的信号强 度，可将各试样间的变动定量地推测。可从具有癌性糖链的蛋白质的量的变动确认各标志 物候补的有意性，进行缩小范围。本实施方式中，通常将候补分子的鉴定工序中使用的AAL 凝集素，在验证时也作为探针蛋白质使用。例如，作为以这样的策略进行实施的例子，可举 出LiuY等的JProteomeRes. 9,798-805(2010)的报道等。已知血清中的蛋白质因其种 类而N键型糖链的结构（支链情况等）、岩藻糖基化修饰（核心岩藻糖、血液型抗原等）不 同。因此，也报道有即使相同的分子也有时受不同的岩藻糖基化修饰。例如，NakagawaT 等的J.Biol. Chem.281,29797-29806(2006)中，公开了α1抗胰蛋白酶受不同的岩藻糖基 化修饰。这些将会