血清制备：以gG蛋白重组抗原免疫猪后，采集含有gG抗体的猪血清， 以上述样品稀释液作20倍稀释制备猪阳性对照血清，分装Iml/瓶。
[0070] 5)底物显色液制备：
[0071] 底物显色A液：醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g，30 %双氧水0· 3ml，蒸馏水加至500ml， 分装为15ml/瓶。
[0072] 底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0. 2g，柠檬酸0. 95g，甘油50ml，取0. 15g TMB溶 于3mlDMS0中，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0073] 6)酶标抗体制备：商品化辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG，用样品稀释液作 1 : 25000倍稀释，分装为25ml/瓶。
[0074] 7)终止液制备：
[0075] 在891. 3ml蒸馏水中逐滴加入浓硫酸（98% ) 108. 7ml，即得2mol/L的H2SO4的水 溶液，混匀后分装为15ml/瓶，室温保存。
[0076] 8)试剂盒组装：
[0077] 根据上述制备方法制备各组分，按每个试剂盒配置包被密封的酶标板2块，样品 稀释液、10倍浓缩洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显示液A，底物显色液B、酶标 抗体、终止液各1瓶，及操作说明书1份进行装盒。
[0078] 实施例4猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒的应用
[0079] 1)从试剂盒中取出酶标板，用样品稀释液将待检血清样本40倍稀释（例如：5ul 的样品加入195ul样本稀释液）。用移液器吸取IOOul混合液至酶标板中，同时设置阳性对 照血清及阴性对照血清各两孔，每孔IOOul。
[0080] 2)在37°C条件下孵育60分钟。
[0081] 3)弃去孔内液体，向孔板中加入大约300ul/孔洗涤液（10倍浓缩液用蒸馏水作 10倍稀释为1倍工作液），静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后 一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0082] 4)每孔加入IOOul酶标抗体。
[0083] 5)在37°C条件下孵育30分钟。
[0084] 6)重复步骤3。
[0085] 7)每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50ul，轻微震荡混匀，避免孔内液体 溢出。
[0086] 8)在37°C条件下孵育15分钟。
[0087] 9)每孔加入50ul终止液，使反应终止。
[0088] 10)测量并记录被检样品和对照的OD值（450nm)。
[0089] 本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD45ta小于0. 25,阳性对照的平均值 大于I. 0试验方能有效。S =样品0D4Mnni值，P =阳性对照的OD 4Μηηι平均值，
[0090] 如果S/P值大于0. 5,样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阳性。如果S/P值小于 或等于0. 5,但大于0. 4,样品应重测。如试验结果不变，应间隔一定时间后从新采样，检测。 如果S/P值小于0. 4,样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阴性。
[0091] 实施例5猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒特异性检测
[0092] 应用猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪瘟、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒，猪口 蹄疫（〇型）的标准阳性血清及猪伪狂犬病阴性血清，以猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂 盒进行检测。检测结果如下表，结果显示：猪伪狂犬病标准阳性血清S/P值为1. 0>阳性判 定临界值〇. 5,其余S/P值均显著低于阴性临界值0. 4。表明该试剂盒检测特异性良好。
[0093] 表1猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒血清特异性检测结果
[0094]
[0095] 对比例1不同gG蛋白重组抗原酶标板检测效果比较
[0096] 一、gG2, gG3蛋白重组抗原制备
[0097] 1)与实施例1同理：提取猪伪狂犬病毒（PRV)基因组，根据GenBank上发表的猪 伪狂犬病毒中国流行株基因序列，针对gG蛋白编码基因的主要抗原位点区域设计了两对 扩增引物：
[0098] gG2 上游引物：ATGAATTCAAGTGGGCAACGTGGATCCT
[0099] gG2 下游引物：TAAAGCTTGTCGTAGTAGTCGGCGTAGTCG
[0100] gG3 上游引物：ATGAATTCGCCACCCTCCCGCCCATC
[0101] gG3 下游引物：TAAAGCTTTCAGGCGGAGGCCACGT
[0102] 2)以PRV基因组为模板，根据上述引物扩增gG蛋白基因片段，将gG基因片段 克隆到T载体上，然后再将基因插入克隆载体pET-32a，构建重组表达载体，分别命名为 pET32a_gG2, pET32a_gG3。
[0103] 3)将构建的pET32a-gG2, pET32a-gG3重组表达载体转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3)中，加 IPTG进行诱导表达。
[0104] 4)将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG2, gG3蛋白重 组抗原。
[0105] 二、包被gG2, gG3蛋白重组抗原的酶标板的制备（与实施例2同理）
[0106] 1)将实施例1得到的纯化后的gG2, gG3蛋白重组抗原，用0. 05MpH9. 6碳酸钠缓 冲液稀释重组抗原，稀释终浓度为5. 6ug/ml，吸取稀释后的重组抗原加入酶标板孔中，每孔 100ul，即包被量为0. 56ug/孔。
[0107] 2)包被条件：将酶标板用封板膜覆盖，置于37°C 30分钟，然后转至4°C过夜孵育 (不低于12h)。
[0108] 3)弃去酶标板孔内液体，然后向板孔中加入大约300ul/孔洗涤液（10倍浓缩液用 蒸馏水10倍稀释为工作液），静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最 后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0109] 4)封闭：用含2% BSA(质量浓度）、5%新牛血清（体积浓度）的0· OlM ρΗ7· 4的 磷酸盐缓冲液封闭酶标板，每孔IOOul。
[0110] 5)封闭条件：将上述加入封闭液的酶标板置于37°C lh，孵育后将孔内液体弃去， 在吸水纸上拍干。
[0111] 6)将酶标板孔加入含5%蔗糖（质量浓度）的0.0 lM PH7. 4的磷酸盐缓冲液室温 孵育3h，弃去孔内液体，自然晾干后，酶标板用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存备用。
[0112] 三、三种gG蛋白重组抗原包被酶标板用于临床样本敏感性及特异性检测比较
[0113] 应用确诊为PRV抗体阳性血清56份及猪伪狂犬病阴性血清38份，均以猪伪狂犬 病毒gG-ELISA检测试剂盒进行检测，比较三种不同抗原检测效果。检测结果如下表2-4,结 果显示：本发明所述gG重组蛋白酶标板检测敏感性及特异性均优于gG2, gG3重组蛋白抗原 酶标板。
[0114] 表 2
[0115]
[0116] 表 3
[0117]
[0120] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被有猪 伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原的酶标板； 所述gG蛋白重组抗原的制备方法如下：以gG蛋白编码基因为模板，利用引物对扩增得 到gG蛋白基因片段，构建重组表达载体，通过原核系统表达gG蛋白重组抗原； 所述引物对包括： 上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA ; 下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，将所述重组表达载体转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3)中，加IPTG进行诱导表达；将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化 后，获得纯化的gG蛋白重组抗原。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述gG蛋白重组抗原的包被量为 0? I-Iug/ 孔。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有猪伪狂犬病毒gG蛋白重组 抗原的酶标板的制备方法包括如下步骤： 1) 将gG蛋白重组抗原用0. 05M pH9. 6的碳酸钠缓冲液稀释gG蛋白重组抗原，加入酶 标板孔中，包被量为0.1 -Iug/孔； 2) 将酶标板用封板膜覆盖，置于37°C下30分钟，然后转至4°C孵育不低于12h ; 3) 弃去酶标板孔内液体，向板孔中加入孔洗涤液，静置3分钟，重复3~5次海次洗 涤时弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干； 4) 用含0. 5-4% BSA、2 % -8 %新牛血清的0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液封闭酶标板； 5) 将酶标板置于37°C下lh，孵育后将孔内液体弃去，在吸水纸上拍干； 6) 向酶标板板孔加入含5%-20%蔗糖的0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液室温孵育3-5h， 弃去孔内液体，自然晾干后，用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存。5. 根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含酶标抗体，所 述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：样品稀释液、洗涤 液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清为gG蛋白重组抗原 免疫猪后，采集含有gG抗体的猪血清。8. 根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液和洗涤液中含有 ProClin300作为防腐剂。9. 权利要求1-8任一项所述的试剂盒在检测猪血清中gG抗体方面的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用具体为： 1) 用样品稀释液将待检血清样本40倍稀释，用移液器吸取IOOul混合液至酶标板中， 同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，每孔IOOul ; 2) 在37°C条件下孵育60分钟； 3) 弃去孔内液体，向孔板中加入大约300ul/孔洗涤液，静置3分钟，重复3~5次，每 次洗涤时弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干； 4) 每孔加入IOOul酶标抗体； 5) 在37°C条件下孵育30分钟； 6) 重复步骤3); 7) 每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50ul，轻微震荡混匀，避免孔内液体溢出； 8) 在37°C条件下孵育15分钟； 9) 每孔加入50ul终止液，使反应终止； 10) 测量并记录被检样品和对照的OD值。
【专利摘要】本发明涉及生物检测领域，具体提供了一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含包被有猪伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原的酶标板；所述gG蛋白重组抗原的制备方法如下：以gG蛋白编码基因为模板，利用引物对扩增得到gG蛋白基因片段，构建重组表达载体，通过原核系统表达gG蛋白重组抗原；所述引物对包括：上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA；下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/543, G01N33/68
【公开号】CN105044350
【申请号】CN201510369986
【发明人】黄书林, 潘文, 乔磊, 李洁, 苏小齐
【申请人】中牧实业股份有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月29日