专利名称：检测病原的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测病原的方法、试剂盒及其引物，尤其涉及一种同时在一个反应液中检测多种病原的方法、试剂盒及其引物对组合。
背景技术：
种苗为农业生产的根本，其优劣与作物生产有密切的关系，栽植优良的种苗，纵然不需改变栽培技术也能提高产值，因此各发达国家皆将健康种苗管理制度列为重要的防疫措施。台湾农委会于1997年召开会议选定13种作物为健康种苗推动对象，其中即包含了甘蔗与文心兰。台湾甘蔗种植面积有1万1千余公顷，制糖与生食甘蔗年产值各约7亿元。近年来甘蔗除制糖与生食用途外亦被开发作为生物质能源作物，因此在台湾有限的土地上，如何有效种植获得更高产量甘蔗更不容忽视。甘蔗的生长期长达一年以上，栽培过程若遭受病害侵袭将影响甘蔗发育且会降低糖产率，而危害甘蔗的病原有很多种，最常见且危害较严重的有 Ustilago scitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xyli subsp、Xanthomonas albilineans等,分别会导致黑穗病、露菌病、宿根矮化病与白条病发生。上述四种病原可感染不只一种宿主，已报道会感染黑穗病的作物有甘蔗、玉米、鼠尾草与小麦等；已报道会感染露菌病的作物有玉米、蔬菜(花椰菜、芹菜与甘蓝等)与水果花卉(香洋瓜、葡萄与玫瑰等)。以上病原造成的病害，会导致植物生长迟缓且降低产量5%以上，造成收成上极大的损失。由于传统判断病害方法所需的时间较长，且需由专业者判断，利用分子生物检测技术检测作物病害，已开始广被接受且重视。因此，发明人经悉心试验与研究，并本着锲而不舍的精神，构思出本发明“检测病原的方法及试剂盒”，以下为本发明的说明。
发明内容
本发明针对4种常见的病原Ustilago scitaminea、PeronosclerosporasaccharicLeifsona xyli subsp>Xanthomonas albilineans 开发快速且灵敏的检测技术，以协助判断病害并辅助健康种苗制度的建立。本发明中依病原的特定基因序列设计专一性引物，成功地建立可以在一个反应液中同时检测多组病原的多重聚合酶链式反应(multiplex PCR)与高灵敏性的实时定量聚合酶链式反应(real-timePCR)技术。针对多重PCR检测，当调整PCR条件至400 2000nM(优选为800nM以上)的dNTP浓度，及3mM 7mM(优选为4mM以上)的Mg2+浓度时，可在一个反应液中同时检测任意目标病原，检测极限为1，000个拷贝。以实时PCR来检测上述病原其扩增效率可达90% 110% (退火温度30 62°C)，检测极限为10个拷贝。除了上述两种PCR，也可使用生物芯片来快速筛检，其是利用本发明设计的专一性引物夹出的基因片段，取其中约25个连续核苷酸作为探针以达到专一性检测之目的。
本发明的主要目的在于提供一种检测病原的方法，包括:提供核酸样本；以及利用至少一组选自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8,SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.10的引物对的序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列来检测该核酸样本中是否存在病原。本发明的另一方面在于提供一种用于检测病原存在与否的试剂盒，包括:至少一组选自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7 和 SEQ IDN0.8,SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10的引物对的序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列。本发明的又一方面在于提供一种检测病原的方法，该病原是选自UstiIagoscitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xylisubsp 和 Xanthomonasalbilineans，该方法包括:(a)提供具有核酸探针的芯片，其中利用至少一组选自SEQ IDN0.3 和 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、SEQIDN0.9和SEQ ID N0.10的引物序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列所扩增的核酸片段中的20-30个连续的核苷酸相同或互补的核苷酸作为该核酸探针；(b)提供待测样本；
(c)使该待测样本与芯片上的核酸探针进行杂交反应；以及(d)鉴定步骤(C)的杂交反应结果。本发明的功效与目的，可通过下列实施方式说明，以便更深入地了解。
图1:同一条件下以实时PCR扩增的退火曲线。图2:实时PCR反应的标准曲线图。图3(A) (E):5组 引物单独PCR检测极限试验，其中图3(A)为2.5S基因；图3⑶为UbE基因；图3 (C)为Lxx基因；图3 (D)为Xa基因；图3 (E)为PS252基因。图4(A) (C):PS252-FR引物总量与Mg2+浓度对PCR反应的影响结果，其中图4(A)为引物总和200nM的反应；图4(B)为引物总和400nM的反应；图4(C)为引物总和800nM的反应。图5:不同基因组合在不同Mg2+浓度下的多重PCR结果，其中图5(A)为2组基因组合反应；图5(B)为3组基因组合反应；图5(C)为4组基因组合反应。图6(A) ⑶:5组引物多重PCR分析结果，其中图6(A)为调整参数前5组引物多重PCR分析结果；图6(B)为调整参数后5组引物多重PCR分析结果。图7:5组引物的多重PCR浓度差异极限分析。图8:例示样品的多重PCR分析结果。
具体实施例方式(一)引物设计本发明的实施例中共使用5组引物，分别为针对甘蔗基因与四种病原Ustilagoscitaminea、Peronosclerospora sacchar1、Leifsona xyli subsp、Xanthomonasalbilineans的基因设计的专一性引物，如表I所不。Ustilago scitaminea以bE mating基因进行比对(Accession N0.EF185086、EF185087、U61290、U61291)，设计 UbE-FR 特异性引物对，可扩增215碱基对产物。Leifsona xyli subsp以ITS序列进行比对(AcessionN0.AF 034641、AF056603、EU723209、DQ232616、DQ232615、AF034642)设计 Lxx-FR 特异性引物对，可扩增 145 碱基对产物。Xanthomonas albilineans 以 ITS(AY940633、AF209751、AF251154、AF251156、AY940629、GQ461740、⑶223221)进行比对，设计的特异性引物对为Xa-FR,可扩增116喊基对产物。Peronosclerospora sacchari发表的序列少，以COX基因序列进行比对(Acession N0.DU116052、EU116053、EU116054、AY286225、EU116058、DQ365724、EF406089)，设计PS252-FR引物对，可扩增252碱基对产物。在内部对照组方面，本发明实施例是选用甘蔗的2.5S基因进行设计，由Acession N0.BQ536525设计2.5S-FR引物对，可扩增171碱基对产物。但是本领域技术人员可以了解的是，对照组的引物对会依据样本来源而异，而样本来源可以是会被上述病源感染的任何植物及环境。因此，对照组的引物对不限于本发明实施例所使用的2.5S-FR引物对，本领域技术人员可以依据样本来源选择适当的对照组引物对。另外，本发明所使用的引物对也不限于表I所揭露之序列，只要表I的序列经些许修饰或变化后仍能用于扩增其各自的目标片段，则该些经修饰或变化的序列都在本发明的保护范围内。上述经修饰或变化的序列可为表I序列的互补序列、衍生序列或简并序列。其中衍生序列是指于SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列的3'端或5'端进行修饰，使其仍与原序列具有70%以上同源性的核苷酸序列，优选为与原序列具有90%以上同源性的核苷酸序列，若仅在5'端进行修饰，则衍生序列是指与原序列具有50%以上同源性的核苷酸序列；简并序列是指SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列中30%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代，优选为10%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。本发明所属技术领域中普通技术人员知道，传统PCR反应中，使用的引物欲得到较佳扩增效果，除了引物本身的结合位置、长度及GC含量比例外，还须调整反应时的引物浓度、离子浓度、反应温度或时间，以使欲扩增的片段被有效且专一的放大。倘若引物对数量以及所要扩增的片段数增加，引物与引物之间的相互作用增加，合适的反应条件也越趋严苛，因此在同一 PCR反应中使用多组引物，且能达到专一性的放大效果，并非相同研究领域轻易可完成的。此外，本发明所属技术领域中普通技术人员还知道，传统PCR检测使用的引物只能适用于单一的检测方式，并不适用于多种检测方式，针对不同类型的PCR设计的引物/引物对，其适用范围也有所不同。实时PCR检测得出的扩增产物(amplicon)彼此间的大小差异必须相同或接近，一般的作法，是将基因片段大小的差异缩小在50bp以内，以获得较佳的检测结果。反之，多样单步骤PCR检测得出的扩增产物彼此间的大小差异必须明显，如此在进行后续电泳分析时才能于同一凝胶上区分。本发明所开发的引物对组合，具有避免形成二聚物、较佳的GC含量比例、基因大小可于同一凝胶上区分，以及PCR退火温度需相近等特性，克服了传统PCR检测使用的引物只能适用于单一检测方式，可分别适用于实时PCR与多重PCR，可于同一条件、同一反应液中，同时进行专一性PCR扩增反应。表I
权利要求
1.一种检测病原的方法，包括: 提供核酸样本；以及利用 至少一组选自 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6, SEQ IDN0.7和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10的引物、其互补序列、其衍生序列或其简并序列来检测该核酸样本中是否存在病原。
2.按权利要求1的方法，其中该病原包括Ustilagoscitaminea、Peronosclerosporasacchar1、Leifsona xyli subsp 以及 Xanthomonas albilineans 中的至少一项。
3.按权利要求1的方法,其中该核酸样本是来自植物或环境样本,且该环境样本包括土壤及水的至少其中之一。
4.按权利要求1的法，还包含: 使用对照组的引物对，其中该对照组引物对为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2、其互补序列、其衍生序列或其简并序列。
5.按权利要求4的方法，其中该衍生序列是指于SEQID N0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列的3'端或5'端进行修饰，使其仍与原序列具有70%以上同源性的核苷酸序列；以及该简并序列是指SEQ IDN0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列中30%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。
6.按权利要求4的方法，其中该衍生序列是指于SEQID N0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列的3'端或5'端进行修饰，使其仍与原序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；以及该简并序列是指SEQ IDN0.1至SEQ ID N0.10或其互补序列中10%以下的核苷酸被其他核苷酸所取代。
7.按权利要求4的方法，其中该核酸样本是来自植物，且该对照组引物对与该植物的基因序列互补，其中该植物包括甘蔗、烟草、鼠尾草、小麦、玉米、花椰菜、香洋瓜、葡萄、柑橘、西红柿、番椒、玫瑰及叶菜类的至少其中之一。
8.按权利要求2的方法，其中所述检测包括 执行多重聚合酶链式反应与实时定量聚合酶链式反应其中之一。
9.按权利要求8的方法，还包括将每一引物对的极限值调整至相同。
10.按权利要求8的方法，其中: 当执行多重聚合酶链锁反应时，使用介于400 2000nM的dNTP浓度，及介于3 7mM的Mg2+浓度；及 当执行实时定量聚合酶链锁反应时，使用介于30 62°C的退火温度(annealingtemperature)。
11.一种用于检测病原存在与否的试剂盒，包括:至少一组选自 SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9和SEQID N0.10的引物序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列。
12.一种检测病原的方法，该病原选自 Ustilago scitaminea、Peronosclerosporasacchar1、Leifsona xyli subsp 和 Xanthomonasalbilineans,该方法包括: (b)提供具有核酸探针的芯片，其中是利用至少一组选自SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7 和 SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10的弓I物序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列所扩增的核酸片段中的20-30个连续的核苷酸相同或互补的核苷酸作为该核酸探针； (b)提供待测样本； (c)使该待测样本与芯片上的核酸探针进行杂交反应；以及 (d)鉴定步骤(C)的杂交反应结果。
13.按权利要求12的方法，其中该步骤(a)还包含:使用对照组的引物对所扩增的核酸片段中的20-30个连续的核苷酸相同或互补的核苷酸作为对照组核酸探针。
14.按权利要求13的方法，其中该对照组引物对为SEQID N0.1和SEQ ID N0.2、其互补序列、其衍生序列或其简并序列，并且该宿主为甘蔗。
15.按权利要求12的方法， 其中步骤(c)之前还包含: 扩增该待测样本；以及 使用标记分子标记该待测样本扩增后的产物。
全文摘要
本发明提供了一种检测病原的方法。该方法包括提供核酸样本；以及利用至少一组选自SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物序列、其互补序列、其衍生序列或其简并序列来检测该核酸样本是否存在病原。
文档编号C12Q1/04GK103088115SQ20111035108
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者黄怡仁, 陈郁璇, 萧耀基, 胡金胜, 陈立祥 申请人:台湾糖业股份有限公司