专利名称：基于腺相关病毒的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的构建及其打靶方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，是关于一种基于腺相关病毒的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒的构建及其打靶方法。
背景技术：
按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入需要的序列，一方面可以构建各种动物模型，用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器，用于廉价生产人们需要而又很难从其他途径得到的生物组分。传统的基因打靶定向修饰依赖于细·胞内自然发生的同源染色体随机交换，然而，这种方法效率非常低，通常只有10_7。因此，这种打靶方法只有在小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中得到应用，但无法应用于体细胞和其他物种的干细胞中。腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科的依赖性病毒属，是最小和最简单的动物病毒，也是一种具有极端寄生性的卫星病毒。AAV通常需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能在其生活周期的繁殖相进行自我复制。1998年，Russell等报道了用AAV作载体进行基因打靶的一系列实验。包括AAV被用于修复人宫颈癌HeLa细胞中neo基因的复合突变，以及在HT-1080人骨肉瘤细胞和正常人成纤维细胞中介导单拷贝X连锁HPRT基因的突变，并获得了较高的打靶频率，在最适条件下整个成纤维细胞组的大约I %在HPRT基因位点发生了打靶。相比之下，采用转染或电穿孔方式获得的基因打靶频率范围在10_6到10_8之间。并且，在许多打靶中，AAV介导的基因表达可以维持终身，充分说明了该载体的持续性。AAV载体打靶的高效率和持续稳定的目的基因表达对基因打靶技术的发展起了很大的推动，对科研甚至临床应用都有一定价值。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种基于腺相关病毒为载体构建的山羊P -乳球蛋白基因打靶质粒及其构建方法。本发明的另一个目的是提供上述山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法。本发明提供了一种基于腺相关病毒为载体的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒，所述质粒具有如下的序列:5’ AAV,左臂，人乳铁蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖体插入序列(IRES)，右臂3’。根据本发明，所述质粒的载体是将pAAV-MCS质粒的反向重复序列旁的Not I位点通过PCR的方法更改为BamH I位点获得。根据本发明，所述质粒除载体外的插入片段的基因顺序为:5’左臂，人乳铁蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖体插入序列(IRES),右臂 3’。
根据本发明，所述左臂的序列为山羊基因组中乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到上游366bp之间的序列。根据本发明，所述右臂的序列为山羊基因组中￠-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到下游380bp之间的序列。根据本发明，所述插入片段具有如SEQ ID NO:1所示的序列。本发明的基于腺相关病毒构建的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法，包括以下步骤:A、将上述质粒与pAAV-RC，pHelper共同转染AAV-293细胞以包装病毒；B、用上述获得的病毒感染山羊细胞24小时；C、加G418筛选感染成功的细胞。
图1是本发明的山羊乳球蛋白基因打靶质粒的线性示意图。图2是本发明的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒的构建示意图。图3是pAAV_MCS质粒不意图。图4是包装AAV-mcherry病毒的AAV-293细胞的红色荧光结果图。图5A是AAV-mcherry病毒滴度测定的HT1080细胞的红色荧光结果图。图5B是AAV-mcherry病毒滴度测定的HT 1080细胞经DAPI染色的紫外检测结果图。图6A是G418筛选感染打靶病毒的山羊iPS克隆结果图。图6B是G418筛选未感染打靶病毒的山羊iPS克隆结果图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明，均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明书特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。实施例1、基于腺相关病毒为载体构建山羊P -乳球蛋白基因打靶质粒设计如下引物:1:5，GCCGGGATCCCCCAGTGCTGGCTCTGACCTG 3，；2:5， GCCGGGATCCCTCACAGGAAGAGGAAATCAGGGC 3，；
3:5， GCCGGGATCCAGGAACCCCTAGTGATGGAGT 3，；其中，引物1、2和3都具有BamH I酶切位点。实验室原有的打革E质粒序列如下:leftarm (3kb)-hlf-loxp-efla-neo-pA-loxp-right arm(5kb)-me l_tk ;pAAV-MCS质粒购自Stratagene,结构如图3所示。由于插入片段中含有Not I位点，因此将载体反向重复序列旁的Not I位点用PCR的方法更改为BamH I。
基于腺相关病毒为载体构建山羊β -乳球蛋白基因打靶质粒的具体步骤如下:如图2所示，以本实验室原有的打靶质粒为模板，1和2引物进行PCR反应，PCR条件为:95°C 2min，一个循环；95°C 15s，62°C 30s, 68°C 5min，35 个循环；68°C l0min，一个循环。PCR扩增获得大小为4809bp的插入片段，序列如下:left arm(366bp)-hlf-loxp-efla-neo-pA-loxp-right arm(380bp)；其中，左臂为山羊基因组中β-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到上游366bp之间的序列，hlf为人乳铁蛋白cDNA，右臂为山羊基因组中￠-乳球蛋白基因从翻译起始子ATG到下游380bp之间的序列。所述插入片段的序列如SEQ IDNO:1所示。以pAAV-MCS质粒为模板，和3引物进行PCR反应，PCR条件为:95°C 2min, 一个循环；95°C 15s，62°C 30s, 68°C 3min，35 个循环；68°C lOmin，一个循环。PCR 扩增获得大小为489Ibp的AAV载体片段。将上述通过PCR获得的AAV载体和插入片段分别用BamH I酶切，酶切产物用DNA纯化试剂盒(购自北京天根公司，货号:DP214-03)进行纯化，然后用T41igase (购自Fermentas,货号:#EL0011)连接,连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞,得到的质粒经酶切鉴定后和理论大小一致，表明质粒构建成功。实施例2、AAV病毒的包装、转染及滴度测定1、包装和转染:AAV-293细胞用DEME培养基培养，按照350万/T75的比例铺175培养瓶，培养48h至70 80%密度时加入AAV包装混合液，继续培养12 24h后更换新鲜培养基，培养66 72h。然后用干冰-乙醇和37°C水浴处理，来回转换4次后室温离心，取上清，_80°C储存。转染细胞的荧光结果如图4所示。所述AAV包装混合液包括如下组分:pAAV_mcherry、pAAV-RC、pHelper质粒各IOug,转染试剂(Fugene) 75ul, opt1-DMEM 1.5ml。由图4的结果可知，能在红色荧光下观察到感染AAV-mcherry病毒的293细胞，证明AAV病毒能有效地进行包装和转染。2、滴度测定:HT1080细胞用DMEM培养基(含10%血清)培养，按照6万个/孔的比例铺24孔板，于37°C培养过夜。弃培养基，按照0,10-4,10-3,10-1的不同稀释梯度加A 1ml的上述病毒，1 2h后加入DMEM培养基(含18%血清)，于37°C培养40 48h后加入800ug/ml的G418，继续培养6天后计数或直接荧光计数，荧光结果如图5所示。滴度计算公式如下:滴度=nX稀释倍数；或(nX60000)/(细胞总数X微升数)；其中，n代表克隆数。由图5的结果可知，图5A为感染AVV-mcherry病毒的HT1080细胞在红色荧光下的克隆数，图5B为经DAPI染色在紫外下观察的总细胞数，AVV-mcherry病毒体积为2ul，计算可得滴度为4.7X 106cfu/ml，证明经包装转染后获得的AVV病毒有较高的效价。实施例3、AAV病毒感染山羊iPS细朐1、确定感染复数(moi):山羊iPS细胞按照2000个/孔的比例铺12孔板，用包装好的pAAV-mcherry感染山羊iPS细胞进行空载对照实验。按照100、500、1000、2000、4000、8000的moi梯度加入pAAV-mcherry病毒，最后确定moi为500,即每个细胞对应加500个
有活性的病毒。
2、打靶病毒感染:山羊iPS细胞按照50万个/孔的比例铺12孔板，培养24h，加入实施例1中所述的滴度为2.5 X IO8的打靶病毒，继续培养24h，加入300ug/ml的G418，培养8天后挑取克隆鉴定，结果如图6所示。由图6的结果可知，图6A为感染病毒的山羊iPS细胞，在G418筛选下能存活，相应地，图6B为未感染病毒的山羊iPS细 胞对照，经G418筛选后细胞不能存活。
权利要求
1.一种基于腺相关病毒为载体的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒，其特征在于，所述质粒具有如下的序列:5’ AAV,左臂，人乳铁蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖体插入序列(IRES)，右臂3’。
2.按权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述质粒的载体是将pAAV-MCS质粒的反向重复序列旁的Not I位点通过PCR的方法更改为BamH I位点获得。
3.按权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述质粒除载体外的插入片段的基因顺序为:5’左臂，人乳铁蛋白cDNA, loxp-ef la-neo-pA-loxp,核糖体插入序列(IRES),右臂3’。
4.按权利要求3所述的左臂，其特征在于，所述左臂的序列为山羊基因组中￠-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到上游366bp之间的序列。
5.按权利要求3所述的右臂，其特征在于，所述右臂的序列为山羊基因组中￠-乳球蛋白基因从翻译起始密码子ATG到下游380bp之间的序列。
6.按权利要求3所述的插入片段，其特征在于，所述插入片段具有如SEQID N0:1所示的序列。
7.一种基于腺相关病毒为载体的山羊￠-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法，其特征在于包括以下步骤: A、将权利要求1中所述的质粒与pAAV-RC，pHelper共同转染AAV-293细胞以包装病 毒； B、用上述获得的病毒感染山羊细胞24小时； C、加G418筛选感染成功的细胞。
8.按权利要求7所述的山羊细胞，其特征在于，所述山羊细胞为山羊iPS细胞。
全文摘要
本发明公开了一种基于腺相关病毒为载体的山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒及其构建方法。本发明还公开了所述山羊β-乳球蛋白基因打靶质粒的打靶方法。
文档编号C12N7/00GK103088062SQ20111035043
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者肖磊, 赵金龙 申请人:中国科学院上海生命科学研究院