专利名称：一种水稻基因定位克隆的新方法
技术领域：
本发明属于生物学的基因定位克隆方法，特别涉及一种水稻基因定位克隆的新方法。
背景技术：
水稻是最重要的粮食作物和模式植物。1991年，日本发起“水稻基因组计划(Rice Genome Program, RGP) ”，先后美国、中国等国家和地区相继加入，成为全球性大科学工程。 与此同时，中国于1992年8月宣布独立开展自己的水稻基因组计划。在1991-2011年这20 年中，先后绘制了水稻遗传图、物理图、转录图、序列图。RGP对农业和作物改良的最大影响是定位、克隆基因，催生了设计育种(Breeding by design).定位基因(或QTL)后可以通过聚合育种或分子标记辅助选择(MA 对品种进行改良。克隆基因可以帮助育种家理解基因功能或通过基因操作(基因工程或分子标记育种)用于新品种选育。迄今为止，定位或克隆的水稻基因约2000个。现有的方法主要是，根据连锁不平衡原理依据重组值确定分子标记与目标基因的遗传距离实行基因定位。通常情况下，分子标记距离目标基因越远，重组体越多，距离越近，重组体越少，直至为零。如果基因两端的分子标记都符合这个规律，则称 “Match”(即基因定位准确，为典型的孟德尔因子)如果图位克隆，则经过精细定位、候选基因、基因功能互补实验，实现反向遗传学方法基因克隆。1995年，美国几个实验室合作，通过此方法克隆了水稻抗白叶枯病基因fe-21，那以后，克隆水稻基因一直沿用这种方法，在这16年中大约克隆了 300余个基因，定位了约 2000余个基因。现有的反向遗传学方法(如上方法)的优点在于(1)在不知道基因功能的条件下可以克服重要农艺性基因；( 技术流程确定，在中等或中等以上规模实验室均可定位或克隆基因。其存在的主要问题及不足之处在于(1)基因效应较小时难以鉴定或克隆到基因；( 目标基因区多态性低或无多态性时难以实行此法；C3)在几个或多个基因以单倍型的形式作用时难以通过此策略精确定位或克隆基因。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻基因定位克隆的新方法。本发明要解决的问题是，(1)通过区间作图或染色体片段代换系鉴定基因效应较小的基因；(2)通过筛选多态性亲本、构建一套多态性材料进而构建作图群体、定位群体、效应群体解决前述多态性问题；(3)通过设定“目标基因区”定位、克隆目标基因。本发明的技术方案是本发明一种水稻基因定位克隆的新方法包括如下主要方法和步骤(1)构建基因定位群体利用两个多态性高的亲本杂交或回交建立基因定位群体，群体指标为，1)多态性为80% ；2)育性正常；3)偏分离位点少于10%。
(2)以F5或BC2 Fl世代为基础材料，构建基因定位群体、作图群体(部分作图)、 基因效应群体。(3)以性状为导向，以区间作图为基本方法确定目标基因区。(4)依据“Match”原理鉴定目标基因。(5)建立多个群体用于鉴定基因效应，以2-3个群体(必要情况下建立次级群体)。(6)当紧密连锁的标记与基因的遗传距离为0. 1-1CM时候选基因，进行功能互补实验。本发明所带来的优点或有益效果本发明所使用的群体除目标基因区外，大部分区域(基因组的其它背景区域)为纯合，在“基因组扫描”阶段减少了实验消耗，作图效率提高、定位基因的时程缩短。因“以性状分离锁定杂合区”，所以，目标基因杂合，目标基因两侧区杂合，容易产生大的“次级群体”，更容易“逼近”目标基因。因为构建了基础群体，其群体多态性高，目标基因多，如果需要构建新的定位群体，可以通过衍生或重新构建新群体。本发明适于定位、克隆多个基因。通过建立“染色体片段代换系群体”可以鉴定单一或少数几个基因区，有利于揭示某些特定性状的基因作用，克隆一个或几个基因。
图1是一种水稻基因定位克隆的新方法的基因定位的基本原理2是一种水稻基因定位克隆的新方法的实施例图
具体实施例方式一种水稻基因定位克隆的新方法包括如下主要方法和步骤(1)构建基因定位群体，利用两个多态性高的亲本杂交或回交建立基因定位群体，群体指标为，1)多态性为80% ；2)育性正常；3)偏分离位点少于10%。(2)以F5或BC2 Fl世代为基础材料，构建基因定位群体、作图群体(部分作图)、 基因效应群体。(3)以性状为导向，以区间作图为基本方法确定目标基因区。(4)依据“Match”原理鉴定目标基因。(5)建立多个群体用于鉴定基因效应，以2-3个群体(必要情况下建立次级群体)。(6)当紧密连锁的标记与基因的遗传距离为0. 1-1CM时候选基因，进行功能互补实验。基因定位的基本原理参见附图1。
具体实施方式
参见附图2.从Ml到M2之间为杂合区，目标基因杂合，基因两侧的区域都为杂合。此区域依据性状分离确定。在集团分析(Bulk anylisns)时，由于该区域多态性高，由性状分离锁定， 所以该区域容易确定。该区域因候选基因的不同分为两种情况，一种情况为主效基因，另一种情况为较大的QTL区间(M1-M2)。这是典型的情况。另外的特殊情况可分解处理。集团分析后实行精细基因定位。精细定位是重新构建次生群体，次生群体有 5000-10000个个体构成，用以基因精细定位。将基因精细定位于数Kb指数十Kb的候选基因区，采用生物信息学技术方法并根据基因定位、基因克隆等方面的知识确定候选基因。对确定的候选基因进行功能互补实验，实验完成后克隆得到目标基因。参考资料[l]Tian F, Li D J, Fu Q, Zhu Z F, Fu Y C, Wang X K, Sun C Q. Construction of introgression lines carrying wild rice(Oryzarufipogon Griff.) segments in cultivated rice (Oryza sativa L. ) background and characterization of introgressed segments associated with yield-related traits. Theoretical and Applied Genetics,2006,112 :570-580.2一种水稻数量性状基因座(QTL)定位的方法中国CN101974620A号专利。3水稻籼粳分类控制基因PHRl及其应用中国CN1778815号专利。
权利要求
1. 一种水稻基因定位克隆的新方法，其特征在于方法和步骤(1)构建基因定位群体利用两个多态性高的亲本杂交或回交建立基因定位群体，群体指标为，1)多态性为80% ；2)育性正常；3)偏分离位点少于10% ；(2)以F5或BC2Fl世代为基础材料，构建基因定位群体、作图群体，部分作图、基因效应群体；(3)以性状为导向，以区间作图为基本方法确定目标基因区；(4)依据“Match”原理鉴定目标基因；(5)建立多个群体用于鉴定基因效应，以2-3个群体，必要情况下建立次级群体；(6)当紧密连锁的标记与基因的遗传距离为0.1-1CM时候选基因，进行功能互补实验。
全文摘要
一种水稻基因定位克隆的新方法。1.构建基因定位群体。2.构建基因定位群体、作图群体、基因效应群体。3.以性状为导向，以区间作图为基本方法确定目标基因区。4.依据“Match”原理鉴定目标基因。5.建立多个群体用于鉴定基因效应。6.当紧密连锁的标记与基因的遗传距离为0.1-1cm时候选基因，进行功能互补实验在“基因组扫描”阶段减少了实验消耗，作图效率提高、定位基因的时程缩短。容易产生大的“次级群体”，更容易“逼近”目标基因。因为构建了基础群体，其群体多态性高，目标基因多，如果需要构建新的定位群体，可以通过衍生或重新构建新群体。适于定位、克隆多个基因。有利于揭示某些特定性状的基因作用，克隆一个或几个基因。
文档编号C12N15/10GK102382820SQ201110350059
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者丁德亮, 亓娜, 孙津伟, 崔晶, 张欣, 施利利, 王松文 申请人:天津农学院