专利名称：用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法
技术领域：
本发明涉及一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法。
背景技术：
分子伴侣(molecular chaperone)是一类相互之间没有关系的蛋白，其功能是帮助含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价组装。这一名称最早由Laskey于1978年首次提出，但直到1987年，Ellis正式给出分子伴侣的概念，分子伴侣协助蛋白质的折叠组装才真正被人们所认识和重视。分子伴侣属热休克蛋白(Heat Shock Proteins，Hsp)，主要包括伴侣蛋白Hsp60、Hsp70和Hsp90三个蛋白质家族。细胞内部是一个大分子高度拥挤的环境，蛋白质浓度可达300mg/mL左右，如此高的浓度使大分子的缔合常数(association constants)增加了102~103倍，正是细胞长期进化发展起来的分子伴侣系统才得以保证肽链的正确折叠。在蛋白质合成过程中，至少50％的蛋白与Hsp70结合，大肠杆菌内约10％、真核生物内约占15％的新合成的蛋白会与Hsp60结合进而完成折叠。Hsp70主要与新生成肽链的疏水部分结合，以抑制蛋白质合成过程中的新生肽链的聚集，而一旦蛋白质合成完成，Hsp60则在其折叠过程中发挥重要作用。
随着新的基因的不断发现和克隆，越来越多的外来基因要进行异体表达以满足人类的需要。在已有的重组蛋白表达体系中，大肠杆菌依然是最为常用的宿主细胞。但是，外源基因在大肠杆菌中表达时产物往往形成没有生物活性的聚集体，即所谓的包涵体。必须对包涵体进行体外再折叠，使之恢复天然构象，这样才能获得有活性的产品。近年来许多严重威胁人类健康的疾病，如老年痴呆症、帕金森氏病等的病因都被认为是与蛋白质错误折叠有关，因此防止或修复蛋白质的错误折叠可以达到治疗这些疾病的目的。分子伴侣协助的蛋白质折叠，就是一种能促进包涵体体外复性及修复蛋白质错误折叠的非常高效且非常有前景的方法。
GroEL/ES属于Hsp60家族的一种分子伴侣。GroEL在GroEL/ES体系促进蛋白质体外折叠中发挥着最为重要的作用，很多情况下可以单独使用，这对于蛋白质复性体系的简化和成本的降低非常有用，人们已经取得了许多成功的应用实例。但是，天然的GroEL来源非常有限，提取成本巨大，再加上目前还没有化学法合成分子伴侣的报道。因此，生产GroEL的重点是基因工程技术方法的研究，即构建GroEL质粒进而通过表达、分离纯化获得分子伴侣。但由于GroEL分子量较大，增加了质粒构建和可溶性表达的难度，提取工艺复杂，操作成本高等缺点，而复性时GroEL的用量较大(与目的蛋白的摩尔比一般≥1)，严重限制了GroEL体外协助蛋白质复性的研究和工业化应用。
小分子伴侣GroEL191-345是一种新型的分子伴侣，它是运用分子克隆技术获得的GroEL顶端区域191-345片段、并保留完整GroEL顶端区域生物活性的表达产物。这样不仅减小了分子伴侣质粒的大小，使得基因工程操作和可溶性表达更为容易，质粒在构建时还具有一个便于分离纯化的多聚组氨酸标签(Histidine Tag)。同时利用多聚组氨酸标签可以使小分子伴侣很容易地与金属亲和介质结合，如Ni-NTA树脂，形成单分散形式的固定化分子伴侣，从而可以重复使用以促进蛋白质折叠复性。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简单、易于掌握、不受环境影响、周期短、见效快的用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法。
其生产步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入5～150mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，150～280rpm摇床中培养8～30小时，按0.1～10％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，150～280rpm摇床中培养4～12小时，再按0.1～10％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其浓度为25～100mg/mL，25～37℃，150～280rpm摇床中培养2～8小时，然后加入终浓度为0.1～1mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4～12小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内，用SDS-PAGE检测诱导表达的结果如图1所示。
2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4～20℃下以1000～8000rpm的速度离心5～30min，弃上清，用25～150mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体细胞，将装有20～500mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率300～650W，工作时间3～5秒，间隔时间3～10秒，共工作80～150次。4～10℃下10000～18000rpm离心30～90min，收集上清液于4～20℃下保存备用。图2证实，超声破碎120次后，小分子伴侣基本上都释放到溶液中。
3)亲和吸附在自动层析系统上将5～50mL破胞后离心的上清液以0.5～5.0cm/h的线速度进样到Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含0～30mM咪唑和0～500mM NaCl的缓冲液清洗层析柱，清洗1～5个柱体积，最后用含200～1000mM咪唑的缓冲液、以1.0～10.0cm/h进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液。收集图3所示的小分子伴侣层析洗脱峰，SDS-PAGE检测显示(图4)，仅有目的蛋白条带。
4)凝胶分离将0.5～2.5mL上面的洗脱液以线速度0.5～4.0cm/h进样到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为8～14mL)，收集体积为2～10mL。采用凝胶过滤层析对小分子伴侣进行纯化，洗脱曲线如图5所示，收集纯化后的小分子伴侣，经质谱测定分子量为18510Da。
5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-35～-45℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得约150mg的高纯度白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
本发明的优点1)目标产物以可溶形式积累于胞内、表达量高目标产物积累于胞内，有利于对产物进行捕获，同时胞内表达的产量高达40～50％，又不至于形成包涵体；2)分离工艺简单、生产周期短本分离制备工艺由离心、亲和吸附和凝胶层析三个操作单元所组成。离心包括细胞破碎约需2h，亲和吸附层析约需3h，凝胶层析约为3h；3)上游兼顾下游，过程集成在上游质粒构建时，将目标产物设计为含有多聚组氨酸标签的融合蛋白，从而有利于下游对产物的捕获和分离纯化；亲和吸附可以起到浓缩与分离的集成作用，一步纯化可以使目标产物达到电泳纯；凝胶层析在上柱前、后都无需脱盐，也具有纯化与脱盐的集成作用；4)生产自动化水平高、操作方便本生产工艺与其它分子伴侣分离方法相比，采用金属离子亲和层析介质(如Ni-NTA等)与自动层析系统等设备，其上样、层析过程与小分子伴侣目标峰的收集均可自动进行；5)占地小本分离操作仅需二十多平方米的实验室即可；6)条件温和、无环境污染。
图1是SDS-PAGE检测小分子伴侣GroEL191-345表达的电泳图，图中1表示不诱导；2表示诱导；M表示标蛋白，自下分子量依次为14400，20100，30000，45000，66000和97000Da；图2是细胞破碎后小分子伴侣的释放结果电泳图，图中1表示破碎120次上清；2表示继续破碎50次上清；3表示处理2的沉淀；M表示标蛋白，分子量大小同图1；图3是小分子伴侣GroEL191-345的亲和层析洗脱曲线；图4是亲和层析后小分子伴侣GroEL191-345的电泳图，图中1表示亲和层析上样液；2表示洗脱的GroEL191-345；M表示标蛋白，分子量大小同图1；图5是小分子伴侣GroEL191-345的凝胶过滤洗脱曲线。
具体实施例方式
用基因工程大肠杆菌生产重组人表皮生长因子的方法，其生产步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入20～100mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到50～200mg/L，30～37℃，150～250rpm摇床中培养10～20小时，按0.5～5％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到50～200mg/L，30～37℃，150～250rpm摇床中培养6～10小时，再按0.5～5％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得浓度为50～200mg/mL，30～37℃，150～250rpm摇床中培养2～8小时，然后加入终浓度为0.2~0.8mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4～10小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4～15℃下以3000～6000rpm的速度离心5～20min，弃上清，用25～150mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体细胞，将装有20～500mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率400～500W，工作时间3～5秒，间隔时间3～5秒，共工作100～130次。4～10℃下12000～15000rpm离心40～60min，收集上清液于4～10℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统上将10～30mL离心上清液以0.8～3.0cm/h的线速度进样到Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含5～20mM咪唑的缓冲液清洗层析柱，清洗1～3个柱体积，最后用含250～800mM咪唑的缓冲液、1.0～5.0cm/h进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将1.0～2.0mL上面的洗脱液以1.0～3.0cm/h的线速度进样到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，然后将蒸馏水以相同的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为8～14mL)，收集体积为3.5～8mL；5)冷冻升华干燥将凝胶分离后的收集液于-37～-42℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得50-250mg的高纯度白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
在本发明工程菌种发酵和分离制备中所用设备及材料如下1)工程菌宿主菌为Escherichia coli BL21(DE3)，质粒为pRSET A GroEL191-345，将质粒转化入宿主菌中即得工程菌。
2)培养基种子培养基(g/L)胰蛋白胨16.0，酵母抽提物20.0，NaCl 5.0；发酵培养基(g/L)胰蛋白胨10.0，酵母抽提物10.0，NaCl 5.0，Na2HPO46.0，KH2PO43.0，NH4Cl 10.0，甘露醇10.0，MgSO40.36，pH7.0；固体培养基(g/L)胰蛋白胨16.0，酵母抽提物20.0，NaCl 5.0，琼脂12.0。
3)设备层析系统(AKTA explorer 100)、层析柱(XK16/20)、进样柱(SuperloopTM50)、凝胶介质(Superdex 75)、电泳仪(Mini VE complete)购自Amersham PharmaciaBiotech；亲和介质Ni-NTA购自QIAGEN；其它试剂均为市售分析纯试剂。
用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣方法的步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入50mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到100mg/L，33℃，180rpm摇床中培养12小时，按2％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，33℃，180rpm摇床中培养10小时，再按2％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其终浓度为50μg/mL，33℃，180rpm摇床中培养3小时，然后加入终浓度为0.5mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养8小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4℃以5000rpm的速度离心10min，弃上清，用80mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体细胞，将装有100mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率500W，工作时间3秒，间隔时间3秒，共工作120次。4℃下12000rpm离心60min，收集上清液于4℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统KTA explorer 100上将20mL离心上清液以1.5cm/h的线速度进样到床层高度为6cm的Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含20mM咪唑、300mM NaCl、pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液清洗层析柱，清洗1.5个柱体积，最后用含500mM咪唑、pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将1.0mL上面的洗脱液以2.0cm/h线速度加到自动层析系统KTA explorer100 Superdex 75凝胶层析柱中，凝胶柱高度为8cm，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为12mL)，收集体积为5mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-40℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得约180mg的高纯度白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
从固体培养基上用牙签挑取单菌落接入10mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到100mg/L，33℃，180rpm摇床中培养16小时，按1％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，33℃，180rpm摇床中培养12小时，再按1％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其终浓度为50μg/mL，33℃，180rpm摇床中培养4小时，然后加入终浓度为0.2mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养7小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4℃以3000rpm的速度离心10min，弃上清，用100mL pH8.0的0.05M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体细胞，将装有50mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率350W，工作时间3秒，间隔时间3秒，共工作150次。4℃下10000rpm离心90min，收集上清液于4℃下保存备用；3)亲和吸附在层析系统上将50mL离心上清液以5cm/h的线速度进样到床层高度为10cm的Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含20mM咪唑、300mMNaCl、pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液清洗层析柱，清洗5个柱体积，最后在10cm/h的线性流速下用含500mM咪唑、pH8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将2.0mL上面的洗脱液以4.0cm/h线速度进样到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，凝胶柱高度为12cm，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为24mL)，收集体积为10mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-40℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得约100mg的高纯度白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
权利要求
1.一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法，其特征在于它的生产步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入5～150mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，120～280rpm摇床中培养8～30小时，按0.1～10％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到10～500mg/L，25～37℃，120～280rpm摇床中培养4～12小时，再按0.1～10％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其浓度为25～100mg/mL，25～37℃，120～280rpm摇床中培养2～8小时，然后加入终浓度为0.1～1mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4～12小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4～20℃下以1000～8000rpm的速度离心5～30min，弃上清，用25～150mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20～500mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率300～650W，工作时间3～5秒，间隔时间3～10秒，共工作80～150次。4～10℃下10000～18000rpm离心30～90min，收集上清液于4～20℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统上将5～50mL破胞后的离心上清液以0.5～5.0cm/h的线速度进样到Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含0～30mM咪唑和0～500mM NaCl的缓冲液清洗层析柱，清洗1～5个柱体积，最后用含200～1000mM咪唑的缓冲液、以1.0～10.0cm/h进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将0.5～2.5mL上面的洗脱液以线速度0.5～4.0cm/h加到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为8～14mL)，收集体积为2～10mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-35～-45℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得50～350mg白色干粉状新型小分子伴侣GroEL 191-345。
2.根据权利要求1所述的一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法，其特征在于它的生产步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入20～100mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到50～200mg/L，30～37℃，150～250rpm摇床中培养10～20小时，按0.5～5％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，使其在培养基中菌体浓度达到50～200mg/L，30～37℃，150～250rpm摇床中培养6～10小时，再按0.5～5％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其浓度为50～200mg/mL，30～37℃，150～250rpm摇床中培养2～8小时，然后加入终浓度为0.2～0.8mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养4～10小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4～15℃下以3000～6000rpm的速度离心5～20min，弃上清，用50～100mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有20～500mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率400～500W，工作时间3～5秒，间隔时间3～5秒，共工作100～130次。4～10℃下12000～15000rpm离心40~60min，收集上清液于4～10℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统上将10～30mL破胞后的离心上清液以0.8～3.0cm/h的线速度进样到Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含5～20mM咪唑和0～300mM NaCl缓冲液清洗层析柱，清洗1～3个柱体积，最后用含250～800mM咪唑的缓冲液、1.0～5.0cm/h进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将1.0～2.0mL上面的洗脱液以1.0～3.0cm/h的线速度加到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为8～14mL)，收集体积为3.5～8mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-37～-42℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得100～350mg得白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
3.根据权利要求1或2所述的一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法，其特征在于它的生产步骤如下1)工程菌发酵从固体培养基上挑取单菌落接入50mL含氨苄青霉素的种子培养基中，使培养基中菌体浓度达到100mg/L，33℃，180rpm摇床中培养12小时，按2％接种量将前面的培养液再次接入含氨苄青霉素的种子培养基中，33℃，180rpm摇床中培养10小时，再按2％接种量将活化的种子液加入到发酵培养基中，同时加入氨苄青霉素使得其终浓度为50μg/mL，33℃，180rpm摇床中培养3小时，然后加入终浓度为0.5mM的安慰性诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导，继续培养8小时，新型小分子伴侣累积在菌体细胞内；2)超声波破胞用冷冻离心机将发酵液于4℃以5000rpm的速度离心10min，弃上清，用80mL 0.05M、pH8.0的Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)悬浮1L发酵液所培养的菌体，将装有100mL悬浮液的烧杯置于冰浴中，用超声波细胞粉碎机破碎细胞，超声波工作功率500W，工作时间3秒，间隔时间3秒，共工作120次。4℃下12000rpm离心60min，收集上清液于4℃下保存备用；3)亲和吸附在自动层析系统上将20mL破胞后的离心上清液以1.5cm/h的线速度进样到床层高度为6cm的Ni-NTA亲和层析柱中，然后在同样的流速下改用含20mM咪唑和300mM NaCl的缓冲液清洗层析柱，清洗1.5个柱体积，最后用含500mM咪唑的缓冲液、进行洗脱直至出峰(280nm吸收峰)，收集该峰洗脱液；4)凝胶分离将1.0mL上面的洗脱液以2.0cm/h线速度加到自动层析系统Superdex 75凝胶层析柱中，凝胶柱高度为8cm，然后用蒸馏水以同样的线速度洗脱直至出峰完毕，用紫外检测仪在波长280nm下进行检测，收集第二个峰的洗脱液(保留体积约为12mL)，收集体积为5mL；5)冷冻干燥将凝胶分离后的收集液于-40℃下冷冻升华干燥，每升发酵液可制得约180mg的高纯度白色干粉状新型小分子伴侣GroEL191-345。
全文摘要
本发明公开了一种用基因工程大肠杆菌生产新型小分子伴侣的方法。它的生产步骤包括，①工程菌发酵将基因工程菌种经种子培养基活化、发酵培养基培养，小分子伴侣累积在菌体细胞内；②超声波破胞发酵培养液离心后将菌体细胞用缓冲液重新悬浮，然后用超声波细胞粉碎机破胞，小分子伴侣以可溶形式释放到溶液中；破胞液离心，收集上清液；③亲和吸附将溶解液用亲和层析柱进行吸附分离，收集含小分子伴侣的洗脱峰；④凝胶分离将收集的洗脱液加入到凝胶层析柱中，层析分离后收集小分子伴侣洗脱峰；⑤冷冻干燥将收集液于－40℃下冷冻干燥，即得高纯度的新型小分子伴侣。本发明具有过程高效、工艺简单、生产周期短、操作方便、生产成本低和无环境污染等优点。
文档编号C12P21/02GK1424403SQ0215447
公开日2003年6月18日 申请日期2002年12月17日 优先权日2002年12月17日
发明者关怡新, 姚善泾, 高永贵, 张佳艺 申请人:浙江大学