专利名称：重组人胰岛素样生长因子-1(igf-1)融合蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及到生物技术中的生物医药领域，尤其是DNA重组技术，即构建 硫氧还蛋白和人IGF-1融合蛋白，并通过基因工程大肠杆菌发酵制备它的方法。
背景技术：
1976年Rillderktercht从人血清中分离得到胰岛素样生长因子 -l(insulin-like growth factor-1， IGF-1)，开始IGF-1研究的新纪元。IGF-I 具有促进生长发育、促进物质代等作用，近年来倍受重视，在治疗胰岛素抗性 糖尿病、神经损伤、矮小症、骨质疏松、分解代谢疾病等方面，具有广阔的应 用前景。目前，国外IGF-1治疗糖尿病、肌肉萎縮侧索硬化症已产业化，但我 国尚未有产品上市(国外有相同名称的产品，但生产方法没有公开)。目前采用 基因工程方法是生产IGF-I的唯一有效方法。
国内报道hlGF-1在大肠杆菌中的表达研究不少，如第一军医大学的吴岚晓 选用含有噬菌体启动子的原核表达载体pRSET B质粒。质粒在大肠杆菌中的拷 贝数高，表达强。他们选择ATG前的Nde 1和HindIII酶切位点克隆外源基因 时可将前导肽编码序列切除，重组质粒转化表达宿主菌BL21后经IPTG诱导， 实现了目的基因的非融合表达。但表达产物的^位氨基酸为甲硫氨酸，而天然 的hIGF-l不含甲硫氨酸。其它作者的表达产物同样含甲硫氨酸。含甲硫氨酸的 产品必须去除甲硫氨酸，这样将大大增加产品的成本。而且有文献报道成熟型 或N端短融合(仅几个氨基酸)型的表达产物是极不稳定的，很难在一般大肠杆 菌中稳定高表达。
pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统。pET系列载体是利用大 肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达。T7表达系统的T7 RNA聚合酶选择性的激 活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速 度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系。pET32是pET系列载体中的融合蛋白表达载体。它含有一 个高度可溶的多肽一硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)，具有催化二硫键的形成 作用。此外，该载体含有的6X组氨酸片段(6xHis tag)对目的蛋白的纯化非 常方便，因为6X组氨酸片段可以和Ni-NTA琼脂糖结合，将样品直接上柱，洗 脱，就可以纯化出带有His Tag的融合蛋白。。
融合蛋白可用蛋白水解酶或化学试剂进行选择性切割获得目的小肽。由于 酶制剂价格昂贵、成本高，该法不适合大规模生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是要提供一种产物稳定，分离方 法简单，成本低，适用于大规模的生产的硫氧还蛋白和人IGF-1融合蛋白，并 通过基因工程大肠杆菌发酵制备它的方法。
本发明解决其技术问题所采用技术方案是 一种重组人胰岛素样生长因子
-1(IGF-l)融合蛋白的制备方法，其特征在于采用基因工程菌发酵法生产a. 重组人IGF-1融合蛋白相关基因设计和合成；b.构建重组人IGF-1融合蛋白 表达载体；C.用所述表达载体转化宿主构建基因工程菌；d.用所述基因工程 菌发酵重组人IGF-1融合蛋白。
所述的相关基因的结构特点是组成融合蛋白的两个蛋白分别是硫氧还蛋白 和IGF-1，两个蛋白之间引入了一个二肽键Asn-Gly;硫氧还蛋白可以促进IGF-1 的二硫键形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加；二肽键作 为羟胺的特异性裂解部分可以在羟胺的作用下断裂，释放出IGF-1，此外，含6 组氨酸系列，从而大大方便纯化工艺。
所述的基因发酵重组人IGF-1融合蛋白的工艺流程如下挑选单菌落基因 工程菌，进行放大培养，诱导表达，收集菌液进行细胞破碎，分离出包涵体，
破坏包涵体，释放出融合蛋白，过Nr-金属螯合柱获得融合蛋白，融合蛋白在
羟胺溶液中裂解，释放重组人IGF-1，分离纯化IGF-1，再脱盐，冷冻干燥样品，质检得最终样品。
所述的载体为商品化的pET32a ( + )，及其替代品。 所述的宿主细胞为DH5ci及其替代品。
所述的融合蛋白中是采用优化的裂解条件，羟胺浓度为2 — 3M，反应的温度 为40—45。C，采用LiOH控制pH8. 5-9. 5,反应时间为5 —IO小时。
1. 根据人IGF-1的初级结构，设计了一个串联表达的融合蛋白，N端为硫氧 还蛋白，C端为IGF-1，中间为自行设计的二肽用于羟胺裂解；
2. 根据人天然IGF-1的DNA序列，设计了二条PCR引物，分别加上EcoRI和 HindIII识别序列，二肽序列和保护性碱基，由EcoRI和HindIII位点定 向克隆到pET32a ( + )表达型质粒，得到表达载体；
3. 阳性克隆发酵条件优化获得高表达的产物;
4. 采用N:T—金属螯合柱层析方法，获得融合蛋白；
5. 融合蛋白经过羟胺裂解释放出IGF-1单体；
6. 采用Ni"—金属螯合柱层析去除未裂解的融合蛋白和裂解的前导肽，获得 IGF-1单体。
本发明的有益效果是由于本发明根据天然工GF-I的第一个氨基酸为甘氨酸 (Gly, G)的特点，在天然的IGF-I前面加上前导肽，而前导肽和IGF-1之间设 计一个羟胺的特异裂解部位(Asn-Gly肽键)，减低纯化成本。前导肽为硫氧还 蛋白，可以促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能 增加。此外，前导肽含6x组氨酸系列，因此，不但可以高效表达，而且可以方 便采用M-金属亲和层析柱将前导肽去处，获得天然的完整IGF-I。
本发明采用串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为IGF-1，使表 达产物更加稳定，分离方法简单，价廉。因此，本发明具有广泛的应用前景。
图1 pET32a ( + )表达载体示意图。
图2 pET32a ( + )表达载体的多克隆位点和表达序列。图中rx Tag代表硫氧化还原蛋白标签，串.109个氨基酸组成；His Tag 代表6个组氨酸标签。
图3 PCR引物1。其中AAC GGT编码Asn-Gly, GAA TTC为Ecorl酶切位占。
"、、o
图4 PCR引物2。包含IGF-1的后面5个氨基酸系列，终止密码(TAG), Hindlll酶切位点(AAGCTT)。 图5 pET32-IGF构建图。
图6 PCR获得的IGF-1 DNA在1. 5%琼脂糖凝胶电泳图谱。 图7融合蛋白诱导表达结果的SDS-PAGE ^谱。
图中从左到右各泳道分别是IPTG诱导1小时、2小时、4小时、6小时、
未转染质粒的空白菌和分子量标记。
图8包涵体总蛋白经过Nr金属螯合柱后得到的融合蛋白SDS-PAGE图谱。 图中从左到右各泳道分别是含400慮(洗脱液稀释5倍)、400 mM、 10 mM、 20、 50、 lOOmM咪唑的磷酸缓冲液洗脱结果。 图9融合蛋白裂解后的图谱。
图中从左到右各泳道分别是分子量标记，未裂解蛋白，裂解蛋白。 图10融合蛋白裂解后纯化的目的蛋白IGF-1的MALDI-TOF-MS图谱。
具体实施例方式
1.融合蛋白基因的克隆
1.1串联表达融合蛋白的设计
天然的IGF-1其N端第一个氨基酸为Gly，不是甲硫氨酸。也就是说在人
体细胞质内合成的IGF-1前体必须去除第一个甲硫氨酸后才被分泌到细胞外。
因此，如果用含基因起始密码ATG的IGF-1基因单独表达的话， 一方面分离纯
化不方便，另一方面去除甲硫氨酸也非常麻烦。^yi中根据羟胺能特异性裂解
Asn-Gly肽键的特点，以及天然IGF-1的第一个氨基酸正好为Asn，而IGF-1整 个蛋白链上没有Asn-Gly 二肽序列的特点，在设计时在前导肽和IGF-1之间设计一个Asn-Gly序列，促进表达和方便纯化。 1.2融合蛋白的基因引物设计
根据pET32a ( + )的多克隆位点序列，在5'端和3'端的两条引物上分别 加上EcoRI和Hindin限制性内切酶位点。 1.3 IGF-l基因的合成
采用PCR法扩增目的基因，扩增程序如下预变性95'C， 5min;变性95。C， lrain;复性64"， lmin;延伸72。C， lmin，共35个循环，最后一次反应延伸 时间为10 min。
取适量PCR产物进行1.5—2y。琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后拍照，其 它PCR产物经电泳染色后采用胶回收试剂盒提取胶中PCR产物。 1.4目的基因插入表达载体pET32a ( + )
目的基因(PCR产物)用EcoRI和mndIII双酶切后进行琼脂糖电泳，回收 DNA片段。pET32a ( + )质粒同样用这两个酶进行酶切后纯化。将目的DNA片段 和酶切后的载体混合进行连接。
连接反应后将反应液直接加到感受态的DH5a大肠杆菌，然后接种到含氨节 青霉素的琼脂糖平板上进行抗性筛选。挑取6个菌落，小量扩增后制备质粒， 并以该质粒为模板，采用上述PCR引物进行扩增r扩增产物进行1.5 — 2%琼脂糖 凝胶电泳，经溴化乙锭染色后估计产物的碱基数目。碱基数目在230bp左右者 为阳性克隆。将阳性克隆的质粒直接进行咖A序列测序。测序正确的菌种保存 在甘油管中(-20°C)。 2.基因工程菌的诱导表达
2. 1.细菌培养和诱导取2ul甘油管中菌液加入到3ml含氨节青霉素的LB培养 液中，37°C， 250转/分，摇床培养过夜。次日取适量菌液，加入到100倍含氨 苄青霉素的LB培养基培养2h，加入IPTG诱导5h。
2.2细菌的破解收集菌液，4000rpm离心10min'，用PBS重悬，超声180次以 裂解细菌。裂解液以12000rpm离心10min，去上清，用1 XPBS洗涤沉淀3次，12000rpm离心lmin，以缓冲液B重悬，室温孵育2h (缓冲液B的组成100Mm NaH2P04、丽m Tris-Cl、 8M尿素、pH8. 0)。然后以12000rpm离心30min，小 心移取上清(细菌裂解液)。
3. 融合蛋白的分离
将适量Ni-NTA树脂(每ml树脂上样的融合蛋白小于15mg)置于层析柱内， 打开柱下端帽子让液体自然流干，加磷酸缓冲液平衡后将细菌裂解液加入， 3(kin后用3(M分别含0、 i0、 20、 50、 lOOmM咪唑的磷酸缓冲液进行阶段洗脱， 流速为2ml/min，洗脱液不搜集。最后用含400mM咪唑的缓冲液进行洗脱，流速 为lnil/min。收集洗脱液，冷冻干燥，一2(TC保存。
4. 羟胺裂解反应
经纯化、冷冻千燥的融合蛋白加入羟胺裂解液(含6M胍，2M羟胺，用5M LiOH 溶液调节到pH9)， 45。C水浴保温4一6小时。反应结束后将反应液透析20小时 后再次上NTA-Ni+琼脂糖层析柱，用不含咪唑的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱液， 冷冻干燥，一20'C保存。
5. 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱系统法鉴定目的蛋白 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱系统(MALDI-TOF—MS)为美国赛弗吉
公司(CIPHERGEN)产品。2次基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法 (MALDI-TOF MS)分析中裂解产物的分子量为分别为7640.0D和7640.8D。 MALDI-TOF-MS仪器的最大测量误差为0. 5%，由于IGF-1的理论分子量为7649D， 因此在误差范围内理论值为7610.7 7687.2。被测蛋白的分子量在此范围内可 认为是IGF-1。SEQUENCE LISTING
〈110〉福建医科大学
〈120〉重组人胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)融合蛋白的制备方法 〈160> 2
〈170〉 Patentln version 3.1 〈210〉 1
〈211〉 210
〈212〉腿
〈213〉人 <400> 1
GGTCCG GMACCCTGTGCGGTGCTGMCTGGTTGACGCT CTG CAG TTC GTTTGCGGTGAC60
CGTGGT TTCTACTTCAACMACCGACCGGTTACGGTTCT TCT TCT CGT CGTGCTCCGCAG120
ACCGGT ATCGTTGACGAATGCTGCTTCCGTTCTTGCGAC CTG CGT CGT CTGGMATGTAC180
TGCGCT CCGCTGAAACCGGCT嵐TCTGCT210
〈210〉
〈211〉
〈212〉
〈213〉 <400>
Gly Pro 1
Arg Gly Thr Gly Cys Ala
2
70
PRT
人 2
Glu Thr Phe Tyr lie Val Pro Leu
Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu
5 10
Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr G土y Ser Ser
25 30
Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu
45 50
Lys Pro Ala Lys Ser Ala
Gin Phe Val Cys Gly Asp 15 20 Ser Arg Arg Ala Pro Gin
35 40 Arg Arg Leu Glu Met Tyr
55 60
65 70
权利要求
1、一种重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)融合蛋白的制备方法，其特征在于采用基因菌发酵法生产a.重组人IGF-1-1融合蛋白基因设计和合成；b.构建重组人IGF-1-1融合蛋白表达载体；c.用表达载体转化宿主构建基因工程菌；d.用基因工程菌发酵重组人IGF-1融合蛋白。
2、 根据权利要求1所述的一种重组人胰岛素样生长因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制备方法，其特征在于所述的基因的结构特点是组成融合蛋白的两个蛋 白分别是硫氧还蛋白和IGF-1，两个蛋白之间引入了一个二肽键Asn-Gly;含6组氨酸系列的纯化工艺。
3、 根据权利要求1所述的基因发酵重组人IGF-1-1融合蛋白的工艺流程如 下挑选单菌落基因工程菌，进行放大培养，诱导表达，收集菌液进行细胞破 碎，分离出包涵体，破坏包涵体，释放出融合蛋白，过Nr-金属金属螯合柱获 得融合蛋白，融合蛋白在羟胺溶液中裂解，释放重组人IGF-1，分离纯化IGF-1， 再脱盐，冷冻干燥样品，质检得最终样品。
4、 根据权利要求1所述的一种重组人胰岛素样生长因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制备方法，其特征在于所述的载体为商品化的pET32a ( + )，及其替代品。
5、 根据权利要求1所述的一种重组人胰岛素样生长因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制备方法，其特征在于所述的宿主细胞为DH5a及其替代品。
6、 根据权利要求1所述的一种重组人胰岛素样生长因子-l(IGF-l)融合蛋 白的制备方法，其特征在于所述的融合蛋白中是采用优化的裂解条件，羟胺 浓度为2 — 3M，反应的温度为40—45。C，采用LiOH控制pH8. 5-9. 5，反应时间 为5 — 10小时。
全文摘要
本发明公开了一种重组人胰岛素样生长因子-1(IGF-1)融合蛋白的制备方法，属生物技术中的生物医药领域。本发明采用基因工程菌发酵法生产a.重组人IGF-1融合蛋白相关基因设计和合成；b.构建重组人IGF-1融合蛋白表达载体；c.用所述表达载体转化宿主构建基因工程菌；d.用所述基因工程菌发酵重组人IGF-1融合蛋白。由于本发明根据天然IGF-I的第一个氨基酸为甘氨酸(Gly，G)的特点，在天然的IGF-I前面加上前导肽，而前导肽和IGF-I之间设计一个羟胺的特异裂解部位(Asn-Gly肽键)，使表达产物稳定，减低纯化成本。本发明采用串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为IGF-1，使表达产物更加稳定，分离方法简单，价廉。因此，本发明具有广泛的应用前景。
文档编号C07K14/65GK101429519SQ20081007237
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月16日 优先权日2008年12月16日
发明者俞昌喜, 廖联明, 渐 杨, 盈 许 申请人:福建医科大学