将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中的制作方法

专利名称:将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中的制作方法
将单基因控制的保绿潜力工程化进植物中
与相关申请的交叉参考
本申请是非临时的实用专利申请，它要求享有下述现有临时专利申请的优先权和利益:Gallie等在2003年6月23日提交的USSN60/480, 861，其标题为“Engineeringsingle-gene-controIledstaygreen potential into plants，，,它在这里为所有目的弓I作参考。
关于在联邦支持的研究和开发下产生的发明权利的声明
本发明得到了 USDA/CREES的资助号95-35304-4657的政府支持和国家科学基金会(National Science Foundation)的资助号MCB-0076434-002的支持。政府可能对该发明具有某些权利。
发明领域
本发明涉及调节植物的保绿(staygreen)潜力，抑制植物的乙烯生产和调节植物的不育性。本发明还提供了敲除的植物细胞，例如，其中破坏了敲除的植物细胞的ACC合酶表达和/或活 性，或敲除的植物，例如，它能表现出保绿表型或雄性不育表型。还包括能编码各种ACC合酶的核酸序列和氨基酸序列。
发明背景
保绿是用于描述植物表型的术语，例如，从而与标准参照相比，延迟了叶子衰老(通过与叶绿素降解有关的叶子的黄化，可以最容易地区分)。参见，Thomas H和HowarthCJ(2000) “Five ways to staygreen，，.Tournal of Experimental Botany51:329_337。在高粱中，已经鉴别出了几个保绿基因型，它们能在籽粒灌浆和成熟的过程中，表现出叶子衰老的延迟。参见，Duncan RR,等(1981) “Descriptivecomparison of senescent andnon-senescent sorghum genotypes.，’Agronomy Tournal73:849_853。而且，在有限水可用性的条件下，这通常会加速叶子衰老(参见，例如，Rosenow DT和Clark LE(1981)Drought tolerance in sorghum.1n:Loden HD,Wilkinson D,编Proceedings of the 36thannual corn and sorghum industryresearch conference, 18-31)，这些基因型倉呆持更多的绿叶区域，且通常能继续灌浆籽粒(参见，例如，McBee GG, Waskom RM, MillerFR,Creelman RA(1983)Effect of senescence and non-senescenceon carbohydrates insorghumduring late kernel maturity states.Crop Science 23:372-377 ；RosenowDT, Quisenberry JE, WendtCff, Clark LE (1983)Drought-tolerant sorghum andcottongermplasm.Agricultural ffater Management :207~222 ;和 Borrell AK, DouglasACL(1996)Maintaining green leaf area ingrain sorghum increases yield in awater-limited environment.1n:Foale MA, Henzell RG, Kneipp JF, 编 Proceedingsof thethird Australian sorghum conference.Melbourne:AustralianInstitute ofAgricultural Science, occasional Publication N0.93)。保绿表型还已经用作开发改良的玉米品种的选择标准,尤其是关于耐旱性的开发。参见,例如，Russell WA(1991)Geneticimprovement of maize yields.Advances in Agronomy46:245~298:和 Bruce 等(2002),“Molecular and physiologicalapproaches to maize improvement for droughttolerance，，.Tournalof Experimental Botany, 53 (366):13_25。
已经描述了 5种根本不同的保绿类型，它们是类型A、B、C、D和E(参见例如，ThomasH,Smart CM(1993)Crops that stay green.Annals of Applied Biologyl23:193_219:和,Thomas和Howarth，同上)。在类型A保绿中，延迟了衰老程序的启动，但是然后以正常的速度进行。在类型B保绿中，尽管衰老程序的启动没有变化，但进展相对更慢。在类型C保绿中，尽管以正常的速度进行衰老(如通过测量生理功能所确定的，例如光合能力)，但仍然能保持叶绿素。类型D保绿是更人工的，因为杀死叶子(即通过冷冻、煮沸或干燥)能阻止衰老程序的启动，从而终止叶绿素的降解。在类型E保绿中，叶绿素的起始水平更高，而叶子衰老的启动和进展没有变化，由此给出了相对更低的进展速度的假象。类型A和B是功能性保绿的，因为光合能力随着叶绿素含量而维持，并且它们是与高粱的高产量和耐旱性相关的类型。尽管有该性状的潜在重要性，尤其是与高产量和耐旱性相关的利益，但在理解遗传决定的保绿的生物化学的、生理的或分子的基础方面，几乎没有取得进展(Thomas和Howarth,同上)。
本发明解决了这些和其他的问题。本发明涉及与植物的保绿潜力表型有关的ACC合酶基因的鉴别和保绿潜力和/或乙烯生产的调节。在阅读了下面的材料以后，会明白由这些基因编码的多肽、调节植物的保绿潜力的方法、抑制植物的乙烯生产的方法、调节植物的不育性的方法、和敲除的植物细胞和植物、以及其他的特征。
发明概述
本发明提供了调节保绿潜力和植物的不育性和调节(例如，抑制)植物的乙烯合成和/或生产的方法和组合物。本发明还涉及植物的ACC合酶核酸序列，示例例如，SEQ IDNO:1 至 SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO: 10，和一组多肽序列，例如，SEQ ID NO:7 至 SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11，它们可以调节这些活性。
在第一方面，本发明提供了分离的或重组的敲除的植物细胞，其包含至少一个内源的ACC合酶基因中的至少一个破坏(例如，核酸序列或其互补序列，其与SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)或 SEQ ID NO:3(gACS7)具有例如至少约 70 %、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的序列同一性。与缺少该破坏的对应的对照植物细胞相比，该破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在一个实施方案中，该至少一个内源的ACC合酶基因包含2个或更多个内源的ACC合酶基因(例如，ACS2、ACS6和ACS7中的任意2个或更多个，例如，ACS2和ACS6)。类似地，在另一个实施方案中，该至少一个内源的ACC合酶基因包含3个或更多个内源的ACC合酶基因。在某些实施方案中，与对照植物细胞相比，该破坏会造成敲除的植物细胞减少乙烯生产。
在一个实施方案中,通过将至少一个包含ACC合酶核酸序列或其子序列的多核苷酸序列导入植物细胞中，从而使至少一个多核苷酸序列以有义或反义方向连接到启动子上，且其中至少一个多核苷酸序列与SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)、SEQ IDNO:3(gACS7)、SEQ ID NO:4(cACS2)、SEQ ID NO:5(cACS6)、SEQ ID NO:6(cACS7)或 SEQID NO:10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %、至少约99 %、约99.5 %或更高的序列同一性，产生了敲除的植物细胞中的至少一个破坏。在另一个实施方案中，通过导入至少一个多核苷酸序列，其包含为RNA沉默或干扰构建的ACC合酶核酸序列的一个或多个子序列，将破坏导入植物细胞中。
在另一个实施方案中，破坏包含一个或多个转座子的插入，其中一个或多个转座子是在至少一个内源的ACC合酶基因中。在另一个实施方案中，破坏包含在至少一个内源的ACC合酶基因中的一个或多个点突变。破坏可以是在至少一个ACC合酶基因中的纯合的破坏。或者，破坏是在至少一个ACC合酶基因中的杂合的破坏。在某些实施方案中，当包含超过一个ACC合 酶基因时，存在超过一个破坏，其可以包括纯合的破坏、杂合的破坏或纯合的破坏和杂合的破坏的组合。
在某些实施方案中，本发明的植物细胞来自双子叶植物或单子叶植物。在一个方面，植物细胞是在包含保绿潜力表型的杂合植物中。在另一个方面，植物细胞是在包含不育表型、例如雄性不育表型的植物中。从本发明的植物细胞再生的植物，也是本发明的特征。
本发明还提供了包含保绿潜力表型的敲除的植物。例如，本发明提供了包含保绿潜力表型的敲除的植物，其中保绿潜力表型源自至少一个内源的ACC合酶基因的破坏。在一个实施方案中，破坏包括一个或多个转座子，且与对应的对照植物相比，能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在另一个实施方案中，破坏包括内源的ACC合酶基因中的一个或多个点突变，且与对应的对照植物相比，能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活性。在某些实施方案中，至少一个内源的ACC合酶基因包含与SEQ ID N0:l(gACS2)、SEQ ID NO:2(gACS6)或SEQ ID NO:3(gACS7)或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %、至少约99 %、约99.5 %或更高的序列同一性的核酸序列。在某些实施方案中，敲除的植物是杂种植物。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
在另一个实施方案中，敲除的植物包括包含保绿潜力表型的转基因植物。例如，本发明的转基因植物包括保绿潜力表型，后者源自至少一个导入的能抑制乙烯合成的转基因。导入的转基因包括能编码至少一种ACC合酶或其子序列的核酸序列，该核酸序列与SEQID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)、SEQ ID NO:3 (gACS7)、SEQ ID NO:4 (cACS2)、SEQID NO:5(cACS6)、SEQ ID NO:6 (cACS7)或 SEQ ID NO: 10 (CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5 %或更高的序列同一性，且其构型能修饰至少一种ACC合酶的表达或活性水平(例如，有义、反义、RNA沉默或干扰构型)。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
本发明的转基因植物也可以包括保绿潜力表型，后者源自至少一个导入的能抑制乙烯合成的转基因，其中所述的至少一个导入的转基因包含能编码至少一种ACC合酶的子序列的核酸序列，该至少一种ACC合酶与SEQ ID NO:7 (pACS2)、SEQ ID NO:8 (pACS6)、SEQID N0.:9(pACS7)或SEQ ID N0.:11 (pCCRA178R)或其保守变体具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的序列同一性。核酸序列一般处于RNA沉默或干扰构型(或者，例如，有义或反义构型)，且能修饰至少一种ACC合酶的表达或活性水平。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。[0019]本发明的植物的保绿潜力包括但不限于，例如，与对应的对照植物相比，(a)减少至少一种ACC合酶特异性的mRNA的生产；(b)减少ACC合酶的生产；(c)减少乙烯的生产；
(d)延迟叶子衰老；(e)增强抗旱性；(f)长时间地维持光合活性；(g)增强的蒸腾；(h)增强的气孔导度;⑴增强的CO2同化作用；(j)增强维持CO2同化作用；或(k) (a)-(j)的任意
组合；等。
本发明的一个方面提供了敲除的或转基因的植物，其包括不育表型，例如，雄性或雌性不育表型。因而，一类实施方案提供了包含雄性不育表型(例如，减少的花粉释放)的敲除的植物，其源自至少一个内源的ACC合酶基因中的至少一个破坏。与对应的对照植物相比，该破坏能抑制至少一种ACC合酶蛋白的表达或活·性。在一个实施方案中，与对照植物相比，至少一个破坏会导致敲除的植物减少乙烯生产。在一个实施方案中，至少一个破坏包括一个或多个转座子，其中一个或多个转座子是在至少一个内源的ACC合酶基因中的。在另一个实施方案中，至少一个破坏包含一个或多个点突变，其中一个或多个点突变是在至少一个内源的ACC合酶基因中的。在另一个实施方案中，通过导入至少一个多核苷酸序列，其包含为RNA沉默或干扰构建的ACC合酶核酸序列的一个或多个子序列，将至少一个破坏导入敲除的植物中。在某些实施方案中，至少一个内源的ACC合酶基因包含与SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)或SEQ ID NO:3(gACS7)或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的序列同一性的核酸序列。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
另一类实施方案提供了转基因的敲除的植物，其包含雄性不育表型，后者源自至少一个导入的能抑制乙烯合成的转基因。至少一个导入的转基因包含能编码至少一种ACC合酶的核酸序列，该核酸序列与 SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)、SEQ ID NO:3(gACS7)、SEQ ID NO:4 (cACS2)、SEQ ID NO:5 (cACS6)、SEQ ID NO:6 (cACS7)或 SEQ IDNO:10(CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有至少约85%序列同一性，且其构型能修饰至少一种ACC合酶的表达或活性水平(例如，反义、有义或RNA沉默或干扰构型)。在某些实施方案中，转基因包括组织-特异性的启动子或诱导型启动子。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
多核苷酸也是本发明的一个特征。在某些实施方案中，分离的或重组的多核苷酸包含选自下述的成员:(a)多核苷酸或其互补序列，其与SEQ ID N0:l(gACS2)、SEQ ID NO:
2(gACS 6),SEQ ID NO:3 (gACS7)、SEQ ID NO:4 (cACS2)、SEQ ID NO:5 (cACS6)、SEQ ID NO:
6(cACS7)或SEQ ID NO: 10 (CCRA178R)或其子序列或其保守变体具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的序列同一性；(b)多核苷酸或其互补序列，其能编码SEQ ID N0:7(pACS2)、SEQ IDNO:8(pACS6)、SEQ ID N0.:9 (pACS7)或 SEQ ID NO:11 (pCCRA178R)的多肽序列或其子序列或其保守变体；(c)多核苷酸或其互补序列，其能在严格条件下与基本上完整长度的包含SEQ ID NO:1 (gACS2)、SEQID NO:2 (gACS6)、SEQ ID NO:3 (gACS 7)、SEQ ID N0:4(cACS2)、SEQ ID NO:5(cACS6)、SEQ ID NO:6(cACS7)或 SEQ ID NO: 10 (CCRA178R)的至少 100 个邻接核苷酸的多核苷酸子序列杂交，或者其能与(a)或(b)的多核苷酸序列杂交；和，(d)多核苷酸，其与(a)、(b)或(C)的多核苷酸序列具有至少约85%同一'丨生。在某些实施方案中，当在植物中表达时，多核苷酸能抑制乙烯生产。
本发明的多核苷酸可以包含或被包含在表达盒或载体中(例如，病毒载体)。载体或表达盒可以包含可操作地连接到该多核苷酸上的启动子(例如，组成型的、组织-特异性的或诱导型的启动子)。本发明的多核苷酸可以以反义方向或有义方向连接到启动子上，被设置用于RNA沉默或干扰等。
本发明还提供了抑制植物中的乙烯生产的方法(和通过这样的方法生产的植物)。例如，抑制乙烯生产的方法包含灭活植物中的一个或多个ACC合酶基因，其中一个或多个ACC合酶基因能编码一种或多种ACC合酶，其中一种或多种ACC合酶中的至少一种与 SEQ ID NO:7(pACS2)、SEQ ID NO:8 (pACS6)、SEQ ID NO:9(pAC7)或 SEQ ID NO:ll(pCCRA178R)具有例如至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的同一性。
在一个实施方案中，灭活步骤包含将一个或多个突变导入ACC合酶基因序列，其中ACC合酶基因序列中的一个或多个突变包含一个或多个转座子，由此与对应的对照植物相比，灭活一个或多个ACC合酶基因。在另一个实施方案中，灭活步骤包含将一个或多个突变导入ACC合酶基因序列，其中ACC合酶基因序列中的一个或多个突变包含一个或多个点突变，由此与对应的对照植物相比，灭活一个或多个ACC合酶基因。一个或多个突变可以包含，例如，在一个或多个ACC合酶基因中的纯合的破坏，在一个或多个ACC合酶基因中的杂合的破坏，或纯合的破坏和杂合的破坏的组合，如果破坏了超过一个ACC合酶基因的话。在某些实施方案中，通过有性杂交导入了一个或多个突变。在某些实施方案中，一个或多个ACC 合酶基因中的至少一个与 SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2(gACS6)或 SEQ ID NO:3(gAC7)或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的同一性。
在另一个实施方案中，灭活步骤包含:(a)将至少一个多核苷酸序列导入植物中，其中至少一个多核苷酸序列包含能编码一种或多种ACC合酶的核酸或其子序列和启动子，该启动子能在植物中起作用，以生成RNA序列；和，(b)表达至少一个多核苷酸序列，由此与对应的对照植物(例如，它的非-转基因亲本或相同物种的非-转基因植物)相比，灭活一个或多个ACC合酶基因。例如，通过多种技术，包括但不限于电穿孔、微粒轰击、土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转移等,可以导入至少一个多核苷酸序列。在本发明的某些方面，多核苷酸以有义方向或反义方向连接在启动子上，或被设置用于RNA沉默或干扰。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案[0027]调节植物的保绿潜力的方法也是本发明的一个特征(通过这样的方法生产的植物也同样是本发明的一个特征)。例如，调节保绿潜力的方法包含:a)选择至少一个ACC合酶基因(例如，能编码 ACC 合酶，例如 SEQ ID NO:7(pACS2)、SEQ ID NO:8 (pACS6)、SEQ IDNO:9 (pAC7)或SEQ ID NO: 11 (pCCRA178R))进行突变，从而提供至少一个需要的ACC合酶基因；b)将突变形式(例如，至少一个ACC合酶基因或其子序列的反义或有义构型，至少一个ACC合酶基因或其子序列的RNA沉默构型，至少一个ACC合酶基因中的杂合突变，至少一个ACC合酶基因中的纯合突变，或纯合突变和杂合突变的组合，如果选择了超过一个ACC合酶基因的话，等)的至少一个需要的ACC合酶基因导入植物；和，c)表达突变形式，从而调节植物的保绿潜力。在一个实施方案中，选择至少一个ACC合酶基因，包含确定需要的保绿潜力的程度(例如，弱、中等或强)。在某些实施方案中，通过土壤杆菌-介导的转移、电穿孔、微粒轰击、有性杂交等，导入突变的基因。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
可以定性地(通过检测是否存在一种或多种目标产物)或定量地(通过监控一种或多种目标产物的表达水平)检测表达产物。在一个实施方案中，表达产物是RNA表达产物。本发明的方面任选地包括监控核酸、多肽或化学药品(例如，ACC，乙烯，等)的表达水平，如本文关于检测植物或植物群体中的ACC合酶、乙烯生产、保绿潜力等所指出的。
本发明的组合物和方法可以包括许多植物，例如，禾本科(Poaceae)(禾本科(Gramineae))的植物。禾本科的成员的实例包括但不限于，Acamptoclados、蓝蓝草属(Achna therum)、Achnella、凤头泰属(Acroceras)、山羊草属(Aegilops)、Aegopgon、Agroelymus、Agrohordeum、Agropogon、冰草属(Agropyron)、Agrositanion、剪股颖属(Agrostis)、银须草属(Aira)、Allolepis、毛颖草属(Alloteropsis)、看麦娘属(Alopecurus)、Amblyopyrum、Ammophila、Ampelodesmos、Amphibromus、Amphicarpum、Amphilophis、Anastrophus、Anatherum、须芒草属(Andropogron)、Anemathele、赖草属(Aneurolepidium)、Anisantha、Anthaenantia、Anthephora、Anthochloa、 黄花茅属(Anthoxanthum)、Apera、水鹿草属(Apluda)、Archtagrostis、Arctophila、Argillochloa、三芒草属(Aristida)、燕麦草属(Arrhenatherum)、草草属(Arthraxon)、Arthrostylidium、青篱竹属(Arundinaria)、野古草属(Arundinella)、芦竹属(Arundo)、Aspris、Atheropogon、燕麦属(Avena)、Avenella、Avenochloa、Avenula、地薇草属(Axonopus) λ 箣竹属(Bambusa)、Beckmannia、Blepharidachne、Blepharoneuron、孑L 颖草属(Bothriochloa)、格兰马草属(Bouteloua)、臂形草属(Brachiaria)、短颖草属(Brachyelytrum)、 短柄草属(Brachypodium)、凌风草属(Briza)、Brizopyrum、Bromelica、Bromopsis、雀麦属(Bromus)、野牛草属(Buchloe)、Bulbilis、拂子茅属(Calamagrostis)、Calamovilfa、CampulosusΛ Capriola、沿沟草属(Catabrosa)、Catapodium、Cathestecum、Cenchropsis、漠黎草属(Cenchrus)、酸模芒属(Centotheca)、Ceratochloa、Chaetochloa、Chasmanthium、方竹属(Chimonobambusa)、Chionochloa、虎尾草属(Chloris)、Chondrosum、Chrysopon、Chusquea、单蕊草属(Cinna)、Cladoraphis、空轴茅属(Coelorachis)、薏该属(Coix) λ 莎禾属(Coleanthus)、Colpodium、Coridochloa、CornucopiaeΛ 蒲華属(Cortaderia)、CorynephorusΛ Cottea、Critesion、隐花草属(Crypsis)、Ctenium、Cutandia、Cylindropyrum、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、洋狗尾草属(Cynosurus)、Cytrococcum、鸭茅属(Dactylis)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、扁芒草属(Danthonia)、Dasyochloa、Dasyprum、Davyella、牡竹属(Dendrocalamus)、发草属(Deschampsia)、Desmazeria、野青茅属(Deyeuxia)、Diarina、龙常草属(Diarrhena)、二型花属(Dichanthelium)、双花草属(Dichanthium)、Dichelachne、Diectomus、马唐属(Digitaria)、雁茅属(Dimeria)、Dimorpostachys、弯穗草属(Dinebra)、双稃草属(Diplachne)、Dissanthelium、Dissochondrus、Distichlis、德序竹属(Drepanostachyum)、Dupoa、Dupontia、稗属(Echinochloa)、Ectosperma、Ehrharta、牛筋草属(Eleusine)、Elyhordeum、Elyleymus、Elymordeum、披减草属(Elymus)、胶鱗禾属(Elyonurus)、Elysitanion、Elytesion、偃麦草属(Elytrigia)、九顶草属(Enneapogon)、肠须草属(Bnteropogon)、Epicampes、幽眉草属(Eragrostis)、娱虫公草属(Eremochloa)、Eremopoa、旱 麦草属(Eremopyrum)、鹿茅属(Erianthus)、Ericoma、Erichloa、Eriochrysis、Erioneuron、 类蜀黍属(Euchlaena)、Euclasta、黄金茅属(Eulalia)、拟金茅属(Eulaliopsis)、真穗 草属(Eustachys)、箭竹属(Fargesia)、羊茅属(Festuca)、Festulolium、Fingerhuthia、 Fluminia、耳稃草属(Garnotia)、Gastridium、Gaudinia、巨竹属(Gigantochloa)、舌甘 茅属(Glyceria)、Graphephorum、Gymnopogon、Gynerium、球稳草属(Hackelochloa)、 Hainardia、Hakonechloa、Haynaldia、Heleochloa、异燕麦属(Helictotrichon)、牛鞭草 属(Hemarthria)、Hesperochloa、Hesperostipa、黄茅属(Heteropogon)、Hibanobambusa、 茅香属(Hierochloe)、Hilaria、域毛草属(Holcus)、Homalocenchrus、大麦属(Hordeum)、 Hydrochloa、膜稃草属(Hymenachne)、荀茅属(Hyparrhenia)、Hypogynium、猬草属 (Hystrix)、距花黍属(Ichnanthus)、白茅属(Imperata)、箬竹属(Indocalamus)、柳叶箬属 (Isachne)、甲鸟嘴草属(Ischaemum)、Ixophorus、Koeleria、Korycarpus、兔草属(Lagurus)、 Lamarckia、Lasiacis、假稻属(Leersia)、千金子属(Leptochloa)、Leptochloopsis、 Leptocoryphium、薄稃草属(Leptoloma)、Leptogon、细穗草属(Lepturus)、Lerchenfeldia、 银稳草属(Leucopoa)、Leymostachys、赖草属(Leymus)、Limnodea、Lithachne、黑麦草 属(Lolium)、Lophochlaena、Lophochloa、Lophopyrum、Ludolfia、Luziola、Lycurus、 Lygeum、Maltea、Manisuris、Megastachya、臭草属(Melica)、糖蜜草属(Melinis)、 Mibora、小草属(Microchloa)、Microlaena、莠竹属(Microstegium)、栗草属(Milium)、 芒属(Miscanthus)、毛俭草属(Mnesithea)、Molinia、Monanthochloe、Monerma、Monroa、 舌L子草属(Muhlenbergia)、Nardus、Nassella、Nazia、Neeragrostis、Neoschischkinia、 Neostapfia、类芦属(Neyraudia)、Nothoholcus、Olyra、Opizia、求米草属(Oplismenus)、 Orcuttia、稻属(Oryza)、落芒草属(Oryzopsis)、Otatea、潰竹属(Oxytenanthera)、 Panicularia、黍属(Panicum)、Pappophorum、假牛鞭草属(Parapholis)、Pascopyrum、类 雀稗属(Paspalidium)、雀稗属(Paspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、藹草属(Phalaris)、 Phalaroides、Phanopyrum、Pharus、Phippsia、梯牧草属(Phleum)、Pholiurus、芦華 属(Phragmites)、刚竹属(Phyllostachys)、Piptatherum、Piptochaetium、大明竹属 (Pleioblastus)、Pleopogon、Pleuraphis、Pleuropogon、早熟禾属(Poa)、Podagrostis、 棒头草属(Polypogon)、单序草属(Polytrias)、新麦草属(Psathyrostachys)、 Pseudelymus、Pseudoroegneria、矢竹属(Pseudosasa)、细柄茅属(Ptilagrostis)、减 茅属(Puccinellia)、Pucciphippsia、Redfieldia、Reimaria、Reimarochloa、Rhaphis、 Rhombolytrum、红毛草属(Rhynchelytrum)、■观草属(Roegneria)、Rostraria、筒轴茅属 (Rottboellia)、Rytilix、甘鹿属(Saccharum)、囊颖草属(Sacciolepis)、赤竹属(Sasa)、 Sasaella、华箸竹属(Sasamorpha)、Savastana、Schedonnardus、齿粹属(Schismus)、 裂稃茅属(Schizachne)、裂稃草属(Schizachyrium)、裂穗草属(Schizostachyum)、 硬草属(Sclerochloa)、Scleropoa、Scleropogon、Scolochloa、Scribneria、黑 麦 属(Seca le)、业平竹属(Semiarundinaria)、Sesleria、狗尾草属(Setaria)、倭竹属 (Shibataea)、Sieglingia、玉山竹属(Sinarundinaria)、唐竹属(Sinobambusa)、慈竹 属(Sinocalamus)、Sitanion、Sorghastrum、高梁属(Sorghum)、大米草属(Spartina)、 Sphenopholis、大油芒属(Spodiopogon)、鼠尾栗属(Sporobolus)、Stapfia、Steinchisma、纯叶草属(Stenotaphrum)、针茅属(Stipa)、Stipagrostis、Stiporyzopsis、Swallenia、Syntherisma> Taeniatherum、Terrellia、Terrelymus、蔽竹属(Thamnocalamus)、菅属(Themeda)、Thinopyrum、卷轴草属(Thuarea)、掠叶芦属(Thysanolaena)、Torresia、Torreyochloa、Trachynia、Trachypogon、锋芒草属(Tragus)、Trichachne、Trichloris、Tricholaena、Trichoneura、Tridens、Triodia、Triplasis、草沙香属(Tripogon)、摩擦草属(Tripsacum)、Trisetobromus、三毛草属(Trisetum)、Triticosecale、小麦属(Triticum)、Tuctoria、Uniola、Urachne> Uralepis、尾稃草属(Urochloa)、Vahlodea、Valota、Vaseyochloa、Ventenata、香根草属(Vetiveria)、Vilfa、Vulpia、Willkommia、玉山竹属(Yushania)、玉蜀黍属(Zea)、英白属(Zizania)、Zizaniopsis 和结缕草属(Zoysia)。在一个实施方案中，植物是玉蜀黍、小麦、稻、高粱、大麦、燕麦、草坪草、黑麦、大豆、番爺、马铃薯、胡椒、嫩茎花椰菜、卷心菜、商业的玉米系等。
整合了一种或多种上述核酸或多肽的试剂盒也是本发明的一个特征。这样的试剂盒可以包括任一种上述组分，且另外包括例如，本文所述的任一种方法中的组分的使用说明书、包装材料、用于容纳组分的容器等。例如，用于调节植物的保绿潜力的试剂盒包括一个容器，其装有至少一个包含核酸序列的多核苷酸序列，其中该核酸序列与SEQ ID NO:l(gACS2)、SEQ ID NO:2 (gACS6)、SEQ ID NO:3 (gACS7)、SEQ ID NO:4 (cACS2)、SEQ ID NO:5(cACS6)、SEQ ID NO:6 (cAC7)或 SEQ ID NO: 10 (CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的同一性。在另一个实施方案中，试剂盒包括关于使用至少一个多核苷酸序列来控制植物的保绿潜力的说明材料。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
作为另一个实例，用于调节植物的不育、例如雄性不育的试剂盒包括一个容器，其装有至少一个包含核酸序列的多核苷酸序列，其中该核酸序列与SEQ ID N0:l(gACS2)、SEQID NO:2 (gACS6)、SEQ IDNO:3 (gACS7)、SEQ ID NO:4 (cACS2)、SEQ ID NO:5 (cACS6)、SEQIDNO:6(cAC7)或SE Q ID NO: 10 (CCRA178R)或其子序列或其互补序列具有例如至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、约99.5%或更高的同一性。试剂盒还任选地包括关于使用至少一个多核苷酸序列来控制植物的不育、例如雄性不育的说明材料。如果恰当，基本上所有的上述特征也适用于该实施方案。
定义
在详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于特定的装置或生物学系统，它当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的，而无意进行限制。如在本说明书和所附权利要求
书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非其内容清楚地作出相反说明。因而，例如，“一个细胞”包括2个或更多个细胞的组合，等等。
除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在描述和要求保护本发明时，根据下述的定义，使用下面的术语。
术语“植物”一般地指下述任意一种:全植物、植物部分或器官(例如，叶子、茎、根，等)、茎干营养器官/结构(例如叶子、茎和块茎)、根、花和花的器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)、果实(成熟的子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织，等)、组织培养愈伤组织和植物细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等)和它们的后代。如本文所使用的，植物细胞还包括但不限于从下述组织中得到的或发现的细胞:种子、培养物、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶子、根、茎干、配子体、孢子体、花粉和小孢子。还可以将植物细胞理解为包括从前述组织得到的修饰的细胞，例如原生质体。
术语“双子叶植物”指双子叶的植物。双子叶的植物属于具有2个子叶(子叶)的被子植物的大亚纲。
术语“单子叶植物”指单子叶的植物，其在发育中的植物只具有I个子叶。
术语“敲除的植物细胞”指具有在细胞的至少一个ACC合酶基因中的破坏的植物细胞，与对照细胞相比，该破坏会导致降低的该基因编码的ACC合酶的表达或活性。敲除可以是例如反义构建体、有义构建体、RNA沉默构建体、RNA干扰、基因组破坏(例如，转座子、TILLING、同源重组，等)等的结果。术语“敲除的植物”指在至少一个细胞中具有至少一个ACC合酶基因破坏的植物。
术语“转基因的”指具有整合的核酸序列的植物，其包括但不限于基因、多核苷酸、DNA、RNA等，与未导入的植物相比，它们已经被导入了植物中。
术语“内源的”涉及已经存在于细胞中的任何基因或核酸序列。
“转座因子”(TE)或“转座性遗传因子”是可以在细胞中从一个位置移动到另一个位置的DNA序列。转座因子的移动可以发生在附加体至附加体、附加体至染色体、染色体至染色体或染色体至附加体。转座因子的特征在于，在它们的末端存在反向重复序列。“转座酶”会酶促地介导移动。在结构上，分别根据除了对于因子的移动必需的序列外，有或没有遗传序列存在，将转座因子分成“转座子”(“TN”)或“插入序列元件”(IS元件)。小-转座子或小-1s元件一般缺少能编码转座酶的序列。
通常，以本领域公知的含义使用术语“核酸”或“多核苷酸”，其指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物，例如，包含核苷酸的修饰的核苷酸聚合物、肽核酸等。在某些应用中，核酸可以是聚合物，其包括多个单体类型，例如RNA和DNA亚基。核酸可以是，例如，染色体或染色体片段、载体(例如，表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针等。核酸可以是，例如，单链的和/或双链的。除非另有说明，除了明确指出的任何序列外，本发明的特定核酸序列任选地包含或编码互补的序列。
术语“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”指单一核酸中的邻接的核苷酸序列或其表示，例如字符串。也就是说，根据上下文，“多核苷酸序列”是核苷酸的聚合物(寡核苷酸、DNA、核酸，等)或代表着核苷酸聚合物的字符串。从任何指定的多核苷酸序列，可以确定特定的核酸或互补的多核苷酸序列(例如，互补的核酸)。
术语“子序列”或“片段”是完整序列的任意部分。
“表型”是由基因表达和环境的相互作用产生的个体植物的性状表现。
“表达盒”是核酸构建体，例如，载体，例如质粒、病毒载体等，其能生产转录物，和，潜在地，由多核苷酸序列编码的多肽。表达载体能体内或体外地在外源细胞中生产转录物，例如，细菌细胞或植物细胞，例如培养的植物原生质体。根据例如选择的启动子，产物的表达可以是组成型的或诱导型的。该定义特别地包括未被翻译或不能被翻译的反义、有义或RNA干扰或沉默构型。在表达载体的上下文中，如果启动子能调节相关的多核苷酸序列的表达，则将所述启动子称作“可操作地连接”在多核苷酸序列上。该术语也适用于替代性的外源基因构建体，例如表达的或整合的转基因。同样地，术语可操作地连接同样适用于与多核苷酸序列有关的替代性的或其他的转录调节序列，例如增强子。
如果多核苷酸序列可以被转录(以剪接的或未剪接的形式)和/或翻译成RNA或多肽或其子序列，则将多核苷酸序列称作“能编码”有义或反义RNA分子或RNA沉默或干扰分子或多肽。
如上下文所指出的，“基因的表达”或“核酸的表达”指DNA向RNA的转录(任选地包括RNA的修饰，例如，剪接)、RNA向多肽的翻译(可能包括多肽的后续修饰，例如，翻译后修饰)或转录和翻译二者。
广泛地，使用术语“基因”指与生物学功能有关的所有核酸。基因一般包括编码序列和/或表达这样的编码序列所需的调节序列。术语“基因”适用于特定的基因组序列，以及由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因也包括不表达的核酸片段，其例如形成其他蛋白的识别序列。不表达的调节序列包括启动子和增强子，调节蛋白例如转录因子会结合在其上面，导致临近或附近序列的转录。
“多肽”是包含2个或更多个氨基酸残基的聚合物(例如，肽或蛋白)。聚合物可以另外包含非氨基酸的元件，例如标记、猝灭剂、保护基团等，且可以任选地包含修饰，例如糖基化等。多肽的氨基酸残基可以是天然的或非天然的，且可以是未取代的、未修饰的、取代的或修饰的。
术语“重组的”指已经通过人为干预，人工地或合成地(非天然地)改变了该材料(例如，细胞、 核酸或蛋白)。可以在处于它的自然环境或状态中的材料上，或从它的自然环境或状态中取出的材料上，进行改变。例如，“重组的核酸”是通过重组核酸产生的，例如，在克隆、DNA改组的过程中或在其他过程中；“重组的多肽”或“重组的蛋白”是通过表达重组的核酸生产的多肽或蛋白。重组的细胞的实例包括含有重组的核酸和/或重组的多肽的细胞。
术语“载体”指可以繁殖核酸和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移核酸的工具。载体包括质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬粒、转座子和人工染色体等，它们可以自主复制，或可以整合进宿主细胞的染色体中。载体还可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由相同链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多-赖氨酸-缀合的DNA或RNAJi _缀合的DNA或RNA、脂质体-缀合的DNA等，它们不能自主复制。
在本发明的上下文中，术语“分离的”指，生物学材料例如核酸或蛋白基本上不含有天然伴随它的或在它的天然存在的环境中与其相互作用的组分。分离的材料任选地包含在它的自然环境(例如细胞)中不与该材料一起发现的材料。例如，如果材料处于它的自然环境(例如细胞)中，则该材料已经被置于对于在该环境中发现的材料而言非天然的细胞中的位置(例如，基因组或遗传因子)。例如，天然产生的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子，等)会变成分离的，如果通过非天然产生的方式将其导入对该核酸而言非天然的基因组的基因座中(例如，载体，例如质粒或病毒载体或扩增子)。分离的植物细胞，例如，可以处于野生型植物细胞的天然环境(例如，全植株)以外的环境中(例如，细胞培养系统或从细胞培养物中纯化的)。
关于多肽的术语“变体”指，相对于参照序列，被改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可以具有“保守的”变化，其中取代的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如，用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可以具有“非保守的”变化，例如，用色氨酸替换甘氨酸。类似的微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入或二者。使用本领域众所周知的计算机程序，例如，DNASTAR软件，可以发现关于确定能取代、插入或删除哪个氨基酸残基、而不消除生物学或免疫学活性的指导。还在下面描述了保守取代的实例。
如本文所使用的，“宿主细胞”是已经被或能被外源的多核苷酸序列转化或转染的细胞。将“外源的多核苷酸序列”定义为指在细胞中非天然的序列，或者其天然地存在于细胞中，但是在不同的遗传基因座中、以不同的拷贝数存在或在不同的调节元件的指导下。
如本文所使用的，“启动子”包括位于转录起点上游且参与RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以启动转录的DNA区域。“植物启动子”是能启动植物细胞的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于，从植物、植物病毒和包含能在植物细胞中表达的基因的细菌得到的那些，所述细菌例如土壤杆菌或根瘤菌(Rhizobium)。在发育控制下的启动子的实例包括能优先启动在某些组织(例如叶子、根或种子)或空间上在诸如胚乳、胚或分生组织区的区域中的转录的启动子。这样的启动子称作“组织-优选的”或“组织-特异性的”。时间上受调节的启动子能在特定时间驱动表达，例如在授粉后0-25天。“细胞类型-优选的”启动子主要驱动一个或多个器官中的某些细胞类型中的表达，例如，根或叶子中的维管细胞。“诱导型”启动子是在环境控制下的启动子，且可以是诱导型的或可去阻抑的。可能影响诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存在。组织-特异性的、细胞类型-特异性的 和诱导型的启动子构成了“非-组成型的”启动子类型。“组成型的”启动子是在大多数环境条件下、在所有或几乎所有组织中、在所有或几乎所有发育阶段中都有活性的启动子。
如本文所使用的，“转化”是当外源DNA已经被导入到细胞膜内时，这样的外源DNA “转化”细胞的过程。外源DNA可以整合或未整合(共价地连接)到构成细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物和酵母中，例如，外源DNA可以维持在附加型元件、例如质粒上。关于更高等的真核细胞，稳定地转化的或转染的细胞是这样的，其中外源DNA已经整合进染色体中，从而它能通过染色体的复制被子细胞所遗传。真核细胞建立细胞系或克隆(其由含有外源DNA的子细胞群体组成)的能力，证实了该稳定性。
附图简述

图1示意地说明了植物例如拟南芥(Arabidopsis)中的乙烯生物合成和信号传导基因。
图2示意地说明了分离的和作图的ACC合酶基因和Mu插入突变。ACC6也称作ACS6, ACC2 也称作 ACS2，且 ACC7 也称作 ACS7。
图3，小图A、B、C和D说明了植物例如玉米中的杂合的ACC合酶敲除。小图A和小图B说明了野生型植物田中的杂合的ACC合酶敲除的植物。小图C和小图D说明了来自杂合的ACC合酶敲除的植物的叶子(小图的左侧)与来自ACC合酶野生型植物的叶子(小图的右侧)的比较。
图4说明了与野生型叶子(左侧)和杂合的敲除的叶子(中间)相比，在纯合的ACC合酶敲除的植物叶子(右侧)中观察到的增强的保绿性状。
图5，小图A、B、C、D、E和F说明了在对照条件(小图A、B和C)或干旱条件(小图D、E和F)下，野生型(B73，+/+)和ACS6无效(15，0/0)突变的叶子的叶子蒸腾(小图A和D)、气孔导度(小图B和E)和CO2同化作用(小图C和F)。关于对照条件，使植物在较好灌溉的条件下生长，并在授粉后40天(dap)，测量了植物的每片叶子。关于干旱条件，使植物在有限水的条件下生长，并在授粉后40天，测量了植物的每片叶子。数值代表着6次测定的平均值。
图6，小图A、B和C说明了野生型(B73，+/+)、ACS2无效(7，0/0)和ACS6无效(15，0/0)突变的叶子的叶子蒸腾(小图A)、气孔导度(小图B)和CO2同化作用(小图C)。使植物在有限水的条件下生长，并在授粉后40天，测量了植物的每片叶子。数值代表着6次测定的平均值。
图7示意地说明了 ACC合酶基因序列的种系发生分析，其中(A47(在本文中也称作ACS2或ACC2)、A50(在本文中也称作ACS7或ACC7)、A65(在本文中也称作ACS6或ACC6))指示着玉米序列，(AtACS...)指示着拟南芥序列，(LeACS...)指示着番茄序列，(籼型(0siACS...)&粳型(OsjACS...))指示着稻序列，(TaACS...)指示着小麦序列，且(MaACS...)指示着香蕉序列。
图8说明了 A47 (也称作ACS2或ACC2)、A50 (也称作ACS7或ACC7)和A65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物(AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、OsjACS, TaACS和MaACS)物种的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了比对，复数(plurality)是 26.00,阈值是 4, Aveffeight 是 1.00, AveMatch 是
2.78,且 AvMisMatch 是-2.25。SEQ ID NO 如下:A47p印 SEQ ID NO:25 ；A50pep SEQID NO:26 ；osiacslpep SEQ ID NO:27 ；osjacslpep SEQID NO:28 ；TaACS2pep SEQ IDNO:29 ；AtACSlpep SEQ I D NO:30 ；AtACS2pep SEQ ID NO:31 ；LeACS2pep SEQ ID NO:32 ；LeACS4pep SEQID NO:33 ；MaACSIpep SEQ ID NO:34 ；MaACS5pep SEQ ID NO:35 ；LeACSlApep SEQ ID NO:36 ；LeACSlBpep SEQ ID NO:37 ；LeACS6pepSEQ ID NO:38 ；AtACS6pep SEQ ID NO:39 ；A65pep SEQ ID NO:40 ；osiacs2pep SEQ ID NO:41 ；AtACS5pepSEQ ID NO:42 ；AtACS9SEQID NO:43 ；AtACS4pep SEQ ID NO:44 ；AtACS8SEQ ID NO:45 ；MaACS2p印 SEQ ID NO:46 ；MaACS3pep SEQ ID NO:47 ；LeACS3pep SEQID NO:48 ；LeACS7pepSEQ ID NO:49 ；0sjACS2pep SEQ ID NO:50 ；0sjACS3SEQ ID NO:51 ；0siACS3pep SEQ IDNO:52 ;和 AtACS7SEQ IDNO:53。
图9说明了 A47 (也称作ACS2或ACC2)、A50 (也称作ACS7或ACC7)和A65 (也称作ACS 6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物(AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、Os jACS、TaACS、MaACS)物种(SEQ ID NO:25-53)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是26.00，阈值是2，Aveffeight是1.00，AveMatch是2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图10 说明了 A47 (也称作 ACS2 或 ACC2)、A50 (也称作 ACS7 或 ACC7)和 A65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与双子叶植物(AtACS、LeACS)和单子叶植物(OsiACS、Os jACS、TaACS、MaACS)物种(SEQ ID NO:25_53)的肽共有序列比对。用较低的严格标准(稍微相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是26.00，阈值是0，Aveffeight是1.00，AveMatch是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图11说明了 Α47 (也称作ACS2或ACC2)和Α50 (也称作ACS7或ACC7)的ACC合酶序列与最类似于ACS2和ACS7的序列(SEQ IDNO:25-39)的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了比对，复数是15.00,阈值是4, Aveffeight是1.00, AveMatch是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图12说明了 Α47 (也称作ACS2或ACC2)和Α50 (也称作ACS7或ACC7)的ACC合酶序列与最类似于ACS2和ACS7的序列(SEQ IDNO:25-39)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是15.00,阈值是2, Aveffeight是1.00, AveMatch是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图13说明了 Α65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与最类似于ACS6的序列(SEQ ID NO:40-53)的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了比对，复数是 14.00，阈值是 4，Aveffeight 是 1.00，AveMatch 是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图14说明了 Α65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列与最类似于ACS6的序列(SEQ ID NO:40-53)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是 14.00，阈值是 2，Aveffeight 是 1.00，AveMatch 是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图15说明了 Α47 (也称作ACS2或ACC2)、Α50 (也称作ACS7或ACC7)和Α65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列(SEQ ID NO: 25-26和40)的肽共有序列比对。用最严格的标准(相同的氨基酸)进行了比对，复数是3.00,阈值是4, AveWeight是L 00, AveMatch是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图16说明了 Α47 (也称作ACS2或ACC2)、Α50 (也称作ACS7或ACC7)和Α65 (也称作ACS6或ACC6)的ACC合酶序列(SEQ ID Ν0:25_26和40)的肽共有序列比对。用严格标准(相似的氨基酸残基)进行了比对，复数是3.00,阈值是2, AveWeight是L 00, AveMatch是 2.78，且 AvMisMatch 是-2.25。
图17小图A、B、C和D说明了野生型和ACC合酶敲除的植物的总叶绿素数据。小图A和B说明了在正常条件(小图A)或干旱条件(小图B)下生长的野生型(B73，+/+)、ACS2无效(0/0)和ACS6无效(0/0)植物在授粉后40天的总叶绿素数据。小图C对比了在正常和干旱条件下授粉后40天的野生型(B73，+/+)和ACS6无效(0/0)植物的总叶绿素。小图D对比了在授粉后30和40天收集的B73 (野生型)植物的总叶绿素。
图18小图A、B、C和D说明了野生型和ACC合酶敲除的植物的可溶蛋白数据。小图A和B说明了在正常条件(小图A)或干旱条件(小图B)下生长的野生型(B73，+/+)、ACS2无效(0/0)和ACS6无效(0/0)植物在授粉后40天的可溶蛋白数据。小图C对比了在正常和干旱条件下授粉后40天的野生型(B73，+/+)和ACS6无效(0/0)植物的可溶蛋白。小图D对比了在授粉后30和40天收集的B73 (野生型)植物的可溶蛋白。
图19，小图A和B说明了幼苗叶子中的乙烯生产。小图A说明了各种系。在小图B中，幼苗叶子被按基因型计算平均值。在小图C中，在20、30和40DAP，检测了野生型(即，B73)植物的每片叶子的乙烯生产。叶子I代表着最老的存活的叶子，叶子11是最年轻的。进行了 3次测量，并报道平均值和标准差。
图20小图A说明了叶绿素数据，小图B说明了可溶蛋白，和小图C说明了核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶表达。在黑暗处理 天后，在成年野生型(即，ACS6/ACS6)、acs2/acs2和acs6/acs6植物的第3最老的叶子(叶子3)、第6最老的叶子(叶子6)和第9最老的叶子(叶子9)中，测量了叶绿素a+b(小图A)和可溶蛋白(小图B)的水平。每天灌溉植物。在处理过程中，每天一次给其他的aCS6/aCS6植物灌溉IOOyM ACC。还显示了灌溉100 μ M ACC、但是保持不具鞘的acs6/acs6叶子。显示了 3种个体植物叶子的平均值和标准差。(小图C)使用稻抗-核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶抗血清，进行了相同叶子的蛋白印迹分析。使用了来自相同鲜重的叶子样品的可溶蛋白。
图21小图A-C说明了 ACS2发夹构建体。小图A是PHP20600的示意图，该PHP20600含有能驱动ACS2发夹(由TRl和TR2组成的末端重复序列)的表达的泛素启动子(UBI1ZMPRO)。RB代表着土壤杆菌右边界序列。说明了 49682碱基对盒的4126碱基对片段。小图B 显示了 ZM-ACS2TR1 的序列(SEQ ID NO: 54)，且小图 C 显示了 ZM-ACS2TR2 的序列(SEQ IDNO:55)。
图22小图A-C说明了 ACS6发夹构建体。小图A是PHP20323的示意图，该PHP20323含有能驱动ACS6发夹(由TRl和TR2组成的末端重复序列)的表达的泛素启动子(UBI1ZMPRO)。RB代表着土壤杆菌右边界序列。说明了 49108碱基对盒的3564碱基对片段。小图B 显示了 ZM-ACS6TR1 的序列(SEQ ID NO:56)，且小图 C 显示了 ZM-ACS6
TR2 的序列(SEQ ID NO:57)。
图23小图A和B说明了 ACS2-和ACS6-发夹构建体发生的事件。小图A中的图显示了 ACS2发夹(PHP20600)的各事件的数目和相关的每个事件的转基因拷贝数。小图B中的图显示了 ACS6发夹(PHP20323)的各事件的数目和相关的每个事件的转基因拷贝数。
详细描述
“保绿”是常用的描述植物表`型的术语。保绿是商业性农业的理想性状，例如，与籽粒灌浆有关的理想性状。如在本文中所述的，已经描述了 5个根本不同的保绿类型，包括类型 A、B、C、D 和 E (参见,例如，Thomas H 和 Smart CM (1993) Crops that stay green.Annalsof Applied Biologyl23:193-219:和 Thomas H和 Howarth CJ (2000) Five ways tostay green.Tournal of Experimental Botany 51:329_337)。但是，仅有非常少的对遗传确定的保绿的生物化学的、生理学的或分子基础的描述。参见，例如，Thomas和Howarth,同上。本发明提供了保绿潜力的分子的/生物化学的基础。
已经显示，许多环境的和生理的条件能显著改变叶子衰老的时间选择和进展，且可以提供关于该性状的基础的一些了解。在环境因素中，光可能是最明显的，且已经长期地认为，通过将脱落的叶子置于黑暗中，可以在许多植物物种中诱导叶子衰老。参见，例如，WeaverLM 和 Amasino RM(2001) Senescence is induced in individuallydarkenedArabidopsis leaves, but inhibited in whole darkenedplants.Plant Physiologyl27:876-886。还已经显示,有限的营养和水可用性会过早地诱导叶子衰老。参见,例如,RosenowDT,等(1983)Drought-tolerant sorghum and cotton germplasm.Agricul tural ffaterManagement :207_222。在生理决定因素中，生长调节剂在指导叶子衰老程序中起关键作用。细胞分裂素水平的改变可以明显延迟叶子衰老。例如，用异戊烯基转移酶(ipt)( —种能编码细胞分裂素生物合成中的限速步骤的土壤杆菌基因)转化的植物，当置于衰老诱导型启动子控制下时，会导致自身调节的细胞分裂素生产和强保绿表型。参见，例如，Gan
S和 Amasino RM(1995)Inhibition of leaf senescence by autoregulated productionofcvtokinin.Science 270:1986-1988。但是，还有参与该性状的其他因素。
例如，乙烯也已经涉入控制叶子衰老(参见，例如，Davis KM和GriersonD(1989)Identification of cDNA clones for tomato(Lycopersicon esculentumMill.)mRNAs that accumulate duringfruit ripening and leaf sencescence inresponse to ethylene.Planta 179:73-80),且一些乙烯生产或感觉受损的双子叶植物也会表现出叶子衰老的延迟(参见，例如，PictonS,等(1993)Alteredfruit ripeningand leaf senescence in tomatoes expressing anantisence ethylene-formingenzyme transgene.The Plant Tournal 3:469-481 ；Grbic V 和 Bleeker AB (1995)Ethyleneregulates the timing of leaf senescence in Arabidopsis.ThePlant Journal
8:95_102 ；和，John I,等(1995)Delayed leafsenescence in ethylene-deficientACC—oxidase antisence tomatoplantss:molecular and physiological analysis.ThePlant.Tournal 7:483_490),其可以通过外源应用乙烯生物合成和作用的抑制剂得到拟表型(参见，例如，Abeles FB,等(1992)Ethylene inPlant Biology.Academic Press, SanDiego, CA)o·[0087]乙烯感觉包含膜-定位的受体，例如，在拟南芥中，所述受体包括ETR1、ERSUETR2、ERS2和EIN4(参见图1)。ETR1、ETR2和EIN4由3个结构域组成:N_末端乙烯结合结构域、推定的组氨酸蛋白激酶结构域和C-末端接受结构域，而ERSl和ERS2缺少接受结构域。基于同源性，已经将这些基因分成2个亚族，其中ETRl和ERSl构成I个亚族，且ETR2、ERS2和EIN4构成另一个。在拟南芥中，对功能丧失的突变体的分析，已经揭示了乙烯会抑制这些受体的信号传导活性和随后的它们活化CTRl的能力，所述CTRl是与哺乳动物的RAF-类型丝氨酸/苏氨酸激酶有关的乙烯反应的负调节剂。乙烯信号转导途径表明，乙烯向受体的结合，会抑制它自身的激酶活性，从而导致CTRl活性的降低，并从而导致EIN2 (其在CTRl下游起作用)活性的增加，最终导致乙烯反应性的增加。已经观察了发育的和对乙烯响应的乙烯受体家族成员的有差别的表达。
在确定乙烯在植物生长和发育中的作用时，鉴别和分析有乙烯生物合成和感觉缺陷的拟南芥和番茄的突变体是有价值的。突变体分析还有助于鉴别和表征乙烯信号转导途径。尽管已经在双子叶植物(例如，拟南芥和番茄)中鉴别出了许多乙烯突变体，但是在单子叶植物(例如，稻、小麦和玉米)中尚未鉴别出这样的突变体。在本文中描述了，例如，ACC合酶缺陷的乙烯突变体(例如，在单子叶植物中)，该ACC合酶是乙烯生物合成途径中的第一种酶。
本发明提供了来自植物的ACC合酶多核苷酸序列，其可以调节植物的保绿潜力和乙烯生产，示例为，例如·，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10，和例如，一组能调节植物的保绿潜力和/或乙烯生产的多肽序列，例如，SEQ ID NO:7至SEQ ID NO=^PSEQID NO=Il0本发明还提供了 ACC合酶缺陷的敲除的植物细胞、和具有保绿潜力表型的敲除的植物、以及具有雄性不育表型的敲除的植物。本发明的植物可以具有比对照植物更好的调节对环境应激的反应的特征，例如，更高的对干旱应激的耐受性。本发明的植物还可以具有比对照植物更高的对其他应激(例如，拥挤，例如，玉米)的耐受性。因而，可以以比农民现在的实践更高的密度，种植本发明的植物。另外，在阐明乙烯在植物发育中所起的调节作用以及它在调节对应激(例如，干旱、拥挤，等)的反应中的作用时，本发明的植物是至关重要的。
棺物中的乙烯
乙烯(C2H4)是气态的植物激素。它具有可变的作用范围，这可以是组织和/或物种特异性的。例如，生理活性包括但不限于，促进食物成熟、双子叶物种的叶子和果实的脱落、花衰老、水生植物的茎伸展、根中的气体空间(通气组织)发育、叶子偏上性的弯曲、茎和茎干膨胀(与矮化有关)、cur cub it中的雌性特征、某些物种中的果实生长、黄化的茎干中的顶钩闭合、根毛形成、凤梨科(Bromeliaceae)的开花、黄化的莖干的横向地性和增加的基因表达(例如，多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、几丁质酶、@-1，3-葡聚糖酶等的)。成熟果实会自然地释放乙烯，且大多数植物组织也会释放乙烯，例如对应激(例如，干旱、拥挤、疾病或病原体攻击、温度(冷或热)应激、创伤，等)作出响应，和在成熟和衰老的器官中。
通过明确的包含ACC合酶推动的S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)向环状氨基酸1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的转化的途径，会从甲硫氨酸生成乙烯(参见，例如，图1)。通过循环5’ -甲硫腺苷，在该过程中保藏硫。
ACC合酶是一种氨基转移酶，它能催化通过将S-腺苷甲硫氨酸转化成ACC、形成乙烯的限速步骤。一般地，该酶需要吡哆醛磷酸作为辅因子。ACC合酶一般地在多基因家族中编码。实例包括本文所述的SEQ ID N0:l-3。各成员可以表现出组织-特异性的调节和/或会被环境的和化学的刺激所诱导。本发明的特征包括ACC合酶序列和子序列。参见本文中标题为“本发明的多核苷酸和多肽”的部分。
然后，通过ACC氧化酶(也称作乙烯形成酶)的作用，从ACC的氧化生成乙烯，其中氰化氢作为副产物，它能被氰丙氨酸合酶解毒。ACC氧化酶在多基因家族中编码，其中各成员能表现出组织-特异性的调节和/或会被环境的和化学的刺激所诱导。缺氧和钴离子会抑制ACC氧化酶的活性。ACC氧化酶是立体特异性的，且使用辅因子，例如，Fe+2、02、抗坏血酸盐等。最后，乙 烯通过氧化代谢成CO2或环氧乙烷和乙二醇。
本发明的多核苷酸和多肽
本发明表征了 ACC合酶的基因序列、编码核酸序列和氨基酸序列的鉴别，所述的序列与例如植物的保绿潜力和/或乙烯生产有关。本发明的序列可以通过调节乙烯的生产，来影响植物的保绿潜力。
本发明的多核苷酸序列包括，例如，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10代表的多核苷酸序列和其子序列。除了在所附的序列表中特别提供的序列外，本发明包括结构上和/或功能上高度相关的多核苷酸序列。例如，能编码SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9和SEQID NO:11代表的多肽序列或其子序列的多核苷酸，是本发明的一个实施方案。另夕卜，本发明的多核苷酸序列包括能在严格条件下与包含SEQ ID NO=1-SEQ ID NO:6和SEQID NO:10中的任一个或其子序列(例如，包含至少100个邻接核苷酸的子序列)的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸还包括设置用于RNA生产的ACC合酶序列和/或子序列，例如，mRNA、反义RNA、有义RNA、RNA沉默和干扰构型，等。
除了本发明的多核苷酸序列、例如在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10所列举的序列外，可以在本发明的组合物和方法中使用基本上与本发明的多核苷酸相同的多核苷酸序列。将基本上相同的或基本上类似的多核苷酸序列定义为，在逐个核苷酸的基础上，与参照多核苷酸(例如，选自SEQ ID N0:l-6和10)的至少一个子序列相同的多核苷酸序列。这样的多核苷酸可以包括，例如，相对于SEQ ID N0:l-6和10中的任一个的插入、缺失和取代。例如，这样的多核苷酸一般与选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:10或其子序列的参照多核苷酸有至少约70%同一性。例如，在对比窗口中的10个核苷酸中，有至少7个与选自例如SEQ ID NO:1-6和10的参照序列相同。经常地,这样的序列与参照序列(例如，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6或SEQ ID N0:10中的至少一个)有至少约70 %、至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %、至少约98 %、至少约99%或至少约99.5%的同一性。上述的本发明的多核苷酸(例如，SEQ ID ΝΟ:1_6和10)的子序列，其包括例如至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约500个、约1000个或更多个邻接核苷酸或它们的互补子序列，也是本发明的一个特征。这样的子序列可以是，例如，寡核苷酸，例如合成的寡核苷酸，分离的寡核苷酸，或全长基因或cDNA。
另外，本发明的多核苷酸包括与上述序列中的任一个互补的多核苷酸序列。
本发明的多肽序列包括，例如，SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11代表的氨基酸序列和其子序列。除了在所附的序列表中特别提供的序列外，本发明包括结构上和/或功能上高度相关的氨基酸序列。例如，除了本发明的氨基酸序列、例如在SEQ IDNO:7至SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11所列举的序列外，可以在本发明的组合物和方法中使用基本上与本发明的多肽相同的氨基酸序列。将基本上相同的或基本上类似的氨基酸序列定义为，在逐个氨基酸的基础上，与参照多肽(例如，选自SEQ ID N0:7-9和11)的至少一个子序列相同的氨基酸序列。这样的多肽可以包括，例如，相对于SEQ IDNO:7-9和11中的任一个的插入、缺失和取代。例如，这样的多肽一般与选自SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11或其子序列的参照多肽有至少约70%同一性。例如，在对比窗口中的10个氨基酸中，有至少7个与选自例如SEQ ID NO:7-9和11的参照序列相同。经常地，这样的序列与参照序列(例如，SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11中的至少一个)有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或至少约99.5%的同一性。上述的本发明的多肽(例如，SEQ ID NO:7-9和11)的子序列，其包括例如至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约50个、至少约75个、至少约100个、至少约500个、约1000个或更多个邻接氨基酸，也是本发明的一个特征。本发明的氨基酸序列或子序列的保守变体也是本发明的氨基酸序列。本发明的多肽任选地是免疫原性的、酶活性的、酶失活的等。
当翻译本发明的多核苷酸序列以形成多肽或多肽的子序列时，核苷酸变化可以导致保守的或非保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是指具有功能上类似的侧链的残基的互换性。本领域众所周知保守取代表，它提供了功能上类似的氨基酸。表I阐述了 6组，它们含有彼此为“保守取代”的氨基酸。在本领域可以得到其他保守取代图表，且可以以类似的方式使用。
表1:保守的取代组
权利要求
1.减少玉米植物中乙烯生产的方法,该方法包含:破坏植物中的内源ACS6基因或ACS6基因产物的表达或活性，其中所述ACS6基因如SEQ ID NO:2所示，或所述ACS6基因产物如SEQ ID NO:8 所示。
2.权利要求
1的方法，其中所述破坏步骤包含将一个或多个突变导入ACS6基因序列，所述ACS6基因序列如SEQ ID NO:2所示或编码SEQ ID NO:8所示的产物，其中ACS6基因序列中的一个或多个突变包含一个或多个转座子，由此与对应的对照玉米植物相比，灭活ACS6基因。
3.权利要求
2的方法，其中所述一个或多个突变包含在ACS6基因中的纯合的破坏。
4.权利要求
2的方法，其 中所述一个或多个突变包含在ACS6基因中的杂合的破坏。
5.权利要求
2的方法，其中通过有性杂交导入一个或多个突变。
6.权利要求
1的方法，其中所述破坏步骤包含将一个或多个突变导入ACS6基因序列，其中ACS6基因序列中的一个或多个突变包含一个或多个点突变，由此与对应的对照玉米植物相比，灭活ACS6基因。
7.权利要求
1的方法，其中破坏步骤包含: (a)将至少一个多核苷酸序列和启动子导入植物中，其中所述至少一个多核苷酸序列如编码ACS6的核酸所示，该启动子能在植物中起作用，以生成RNA序列；和， (b)表达至少一个多核苷酸序列，由此与对应的对照玉米植物相比，灭活内源的ACS6基因。
8.权利要求
7的方法，其中通过电穿孔、微粒轰击或土壤杆菌-介导的转移，导入至少一个多核苷酸序列。
9.权利要求
7的方法，其中所述多核苷酸以有义方向连接在启动子上。
10.权利要求
7的方法，其中所述多核苷酸以反义方向连接在启动子上。
11.权利要求
7的方法，其中所述多核苷酸设计用于RNA沉默或干扰。
12.权利要求
7的方法，其中所述启动子是组织-优选的启动子、时间上受调节的启动子或诱导型的启动子。
13.调节玉米植物的保绿潜力的方法，该方法包含: (b)将ACS6基因的突变形式导入植物，其中所述ACS6基因如SEQID NO:2所示或编码SEQ ID NO:8所示的产物；和， (c)表达突变形式，从而调节植物的保绿潜力。
14.权利要求
13的方法，其中所述植物的保绿潜力包含: 与对应的对照玉米植物相比， (a)减少ACS6特异性的mRNA的生产； (b)减少ACS6蛋白的生产； (C)减少乙烯的生产； (d)延迟叶子衰老； (e)增强抗旱性； (f)延长的维持光合活性的时间； (g)增强的蒸腾； (h)增强的气孔导度；(i)增强的CO2同化作用； U)延长的维持co2同化作用的时间；或， (a)-(j)的任意组合。
15.权利要求
13的方法，其中所述突变形式包含ACS6基因中的杂合突变。
16.权利要求
13的方法，其中所述突变形式包含ACS6基因中的纯合突变。
17.权利要求
13的 方法，其中所述突变形式通过土壤杆菌-介导的转移、电穿孔、微粒轰击或有性杂交导入。
18.用于调节植物的保绿潜力的试剂盒，该试剂盒包含:如SEQID NO:2(gACS6)或SEQID N0:5(cACS6)所示的至少一个多核苷酸序列，或其互补序列。
19.权利要求
18的试剂盒，其中所述的试剂盒还包含关于使用至少一个多核苷酸序列来调节植物的保绿潜力的说明材料。
20.用于调节植物的花粉释放的试剂盒，该试剂盒包含:如SEQID NO:2(gACS6)或SEQID N0:5(cACS6)所示的至少一个多核苷酸序列，或其互补序列。
21.权利要求
20的试剂盒，其中所述的试剂盒还包含关于使用至少一个多核苷酸序列来调节植物的花粉释放的说明材料。
专利摘要
将ACC合酶家族的酶用于生产乙烯。与具有ACC合酶的表达和/或活性的抑制的敲除的植物细胞、以及能表现出保绿表型、雄性不育表型或乙烯生产的抑制的敲除的植物一起，提供了ACC合酶的核苷酸和多肽序列。还提供了调节植物的保绿潜力的方法、调节植物的不育性的方法和抑制植物的乙烯生产的方法。
文档编号C12N15/82GKCN1871346 B发布类型授权 专利申请号CN 200480024206
公开日2013年5月29日 申请日期2004年6月22日
发明者D·R·加利伊, R·米莱, T·扬 申请人:先锋高级育种国际公司, 加州大学评议会导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),