编码植物转录因子的基因的制作方法

专利名称：编码植物转录因子的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及调节水稻衍生的环境胁迫耐受性的蛋白质，编码该蛋白质的基因，和利用该蛋白质的方法。
现有技术在自然界中植物具有对抗各种类型的环境胁迫例如脱水，高温，冰冻或盐胁迫的耐受性机理。在具有这样的环境胁迫耐受性的植物的生产中，已经使用了遗传工程选择和交配具有脱水，盐，或低温耐受性的品系的技术。但是，这些技术需要很长的时间进行选择，其成功率较低。
另一方面，由于在分子水平上阐明了胁迫耐受性的机理，已经利用生物技术生产胁迫耐受性的植物。例如，已经证明当将它们暴露于环境胁迫时细胞中诱导了胁迫反应蛋白质例如LEA蛋白质，水通道蛋白质，或合成相容性溶质的合成酶，从而在这样的胁迫中保护细胞。因此，已经尝试了这样的研究，其中将例如大麦的LEA蛋白质或烟草的解毒酶的基因，或渗透压调节物质(例如糖，脯氨酸，或甘氨酸甜菜碱)的合成酶的基因导入到宿主植物。还尝试利用编码拟南芥的W-3脂肪酸去饱和酶，蓝绿藻的D9-去饱和酶的基因等进行研究，这些酶是细胞膜脂类修饰酶。在上面的研究中，将一个基因结合到椰菜花叶病毒的35S启动子并且导入到植物。但是重组植物的胁迫耐受性水平是低的并且不稳定的。因此，这些植物没有投入使用。
另一方面，发现胁迫耐受性机理与几种基因有固有的联系(Plant Physiol1157-334(1997))。因此，已经尝试了将同时激活基因表达的编码转录因子的基因导入植物，从而加强植物的胁迫耐受性的研究(植物细胞，101-17(1998))。但是，当几个基因被同时激活时，宿主植物的能量变成指导基因产物的产生或由基因产物导致胞内代谢。因此，植物本身的生长受害或延缓。
相反，本发明人已经分离了结合到胁迫反应元件并且特异性地激活位于来自于拟南芥的元件下游的基因转录的转录因子的编码基因DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，和DREB2B，(日本专利申请待审(公开)No.2000-60558)。他们报道在植物中导入并且过量表达这些基因能够给与植物胁迫耐受性，不会导致植物的生长延缓(日本专利申请待审(公开)No.2000-116260)。
将拟南芥分类为双子叶植物，而许多作物例如水稻，玉米，和小麦分类为单子叶植物。根据植物进化的观点，双子叶植物和单子叶植物有许多不同。已经证实拟南芥的DREB1A基因在单子叶植物中也起作用，但是在双子叶植物中不起作用。因此如果可以分离来自于单子叶植物的DREB同源基因，可以将环境胁迫耐受性更有效转移到单子叶植物。
本发明达到的目的本发明的目的之一是从例如水稻等单子叶植物鉴别编码特异于胁迫耐受性基因的转录因子的基因，并且利用该基因提供新的环境耐受性植物。
达到该目的手段本发明人已经进行了集中的研究以便达到上述目的。结果，它们已经成功地从水稻基因组鉴别了所有的DREB同源基因。他们也发现将这些基因导入到其它植物显著加强了它们的胁迫耐受性。这导致完成本发明。
更具体地说，本发明提供了下列(1)到(12)。(1)含有下面的DNA(a)或(b)的分离基因(a)含有如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；或(b)与包含一种核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，并且编码调节定位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质的DNA，其中所述核苷酸序列与含有SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA互补。(2)编码下面的蛋白质(c)或(d)的分离基因(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白质；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且调节定位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质。(3)根据上述(1)或(2)所述的基因，其中胁迫是脱水胁迫，低温胁迫或盐胁迫。(4)下面的重组蛋白质(c)或(d)(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQID NO10所示的氨基酸序列的蛋白质；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且调节定位于胁迫反应元件的下游的基因转录的蛋白质。(5)根据上述(4)所述的蛋白质，其中胁迫是脱水胁迫，低温胁迫或盐胁迫。(6)包括(1)到(3)任一项所述的基因的重组载体。(7)用上述(6)所述的重组载体转化的转化体。(8)根据上述(7)所述的转化体，其中宿主是植物。(9)根据上述(7)所述的转化体，其中宿主是单子叶植物。(10)生产调节位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质的方法，其中将上述(8)或(9)的转化体在培养基中培养并且从得到的培养基产物中回收蛋白质。(11)确定植物的胁迫水平的方法，其中在植物体中确定了上述(1)到(3)任一项所述的基因的转录水平。(12)通过将权利要求(1)到(3)任一项所述的基因导入到植物中改善植物的胁迫耐受性的方法。
本说明书包括在日本专利申请No.2001-358268说明书中公开的所有或部分内容，它是本发明的优先权文件。
实施本发明的具体方案本发明的基因是来源于水稻基因组的基因，该基因具有抗环境胁迫例如低温，脱水或盐胁迫的耐受性改善机制。
本发明的基因是“编码结合到顺式元件的转录因子的分离的基因，所述的元件位于编码胁迫反应蛋白质的基因的上游，该蛋白质响应环境胁迫例如低温，脱水，或盐胁迫而表达，从而激活该基因的转录”。上述顺式元件的特定的例子包括脱水反应元件(DRE)，脱落酸反应元件(ABRE)，低温反应元件。由本发明的基因编码的蛋白质激活位于上面提到的胁迫反应元件(DRE等)的下游的基因的转录。
本发明的基因可以按照例如下面所述进行鉴别。I本发明基因的鉴别基于与具有同源功能的已知基因，即编码特异于植物的胁迫耐受性基因的转录因子的基因的同源性可以筛选本发明的基因。可以制备水稻的mRNA和cDNA文库或水稻基因组文库并且可以用于筛选。或者，将现存的水稻DNA数据库进行筛选。(1)基因文库的筛选i)mRNA和cDNA文库的制备最初，mRNA和cDNA文库按如下方法制备。
对于mRNA的来源，可以使用水稻植物体的一部分例如叶，茎，根，或花，或整个植物体。或者，通过在固体培养基例如GM培养基，MS培养基，或#3培养基上播种水稻种子，将它们在无菌条件下生长获得植物体。该来源可以是无菌条件下生长的愈伤组织或培养的水稻细胞，对其品种没有特别的限制，只要细胞含有需要的基因的mRNA。此外，由于待筛选的基因响应环境胁迫而表达，可以优先使用与低温胁迫(例如10到-4℃)，盐胁迫(例如150到250mM氯化钠)，或脱水胁迫(例如脱水状态)接触的植物。
例如，按照如下所述制备mRNA。将已经在低温胁迫，脱水胁迫或盐胁迫条件下通过水耕法生产的水稻植物体暴露，然后用液氮冷冻。冷冻的植物体用研钵研磨。从上述获得的经研磨的这些材料，采用乙二醛方法，硫氰酸胍-氯化铯方法，氯化铝-脲方法，蛋白酶K-脱氧核糖核酸酶方法等提取和制备粗制的RNA组分。然后从这些RNA粗组分利用寡聚dT-纤维素或多聚U-Sepharose在Sepharose 2B亲和柱上或通过分批方法，获得多聚(A)+RNA(mRNA)。此外通过蔗糖密度梯度离心等可以对得到的mRNA进一步分馏。
此外，利用由此获得的mRNA作为模板可以制备cDNA文库。例如，利用寡聚(dT)引物或随机引物，和在商品试剂盒(例如ZAP-cDNA合成试剂盒Stratagene)中的反转录酶合成单链cDNA。然后，从获得的单链cDNA合成双链cDNA。随后，将含有合适的限制性位点的接合子加到获得的双链cDNA，然后将其插入到λ噬菌体载体的克隆位点。利用Gigapack III Gold包装提取物(Stratagene)等等包装获得的DNA，并且感染到大肠杆菌缩主，然后扩增。此后，回收和储藏噬菌体颗粒。
ii)基因组文库的制备例如，按照下列方式利用λ噬菌体载体制备基因组文库。作为DNA的来源，可以使用水稻植物体的一部分例如叶，茎，根或花，或整个植物体，只要该组织含有DNA。在液氮存在下将植物体磨成粉，通过CTAB的方法，苄基氯方法等提取DNA。将获得的DNA用限制性酶Sau3AI部分分解，然后通过氯化钠密度梯度超离心等分馏以回收10-20kb片段。将这些片段插入到λ噬菌体载体例如λEMBL3和λFIXII的BamHI裂解位点。此后，利用Gigapack III金包装提取物(Stratagene)等进行包装，随后感染到大肠杆菌宿主。然后回收扩增的噬菌体颗粒并且储藏。
iii)文库的筛选按下列方式可以筛选文库。
基于例如编码特异于植物的胁迫耐受性基因的转录因子的已知基因，例如来源于拟南芥的DREB基因(DREB1A基因SEQ ID NO11，DREB2A基因SEQID NO12，DREB1B基因SEQ ID NO13，DREB1C基因SEQ ID NO14，DREB2B基因SEQ ID NO15)的高度保守区域的序列制备作为探针的DNA片段？通过利用具有约15bp到25bp的两种引物进行PCR，可以扩增探针DNA，所述的引物是基于高度保守区域的每侧的序列设计的，以便扩增所述的区域。如果高度保守的区域是短的，不足于作为探针，可以设计引物以扩增几个高度保守的区域及其相邻区域。
利用上面的探针，通过噬斑杂交或菌落杂交筛选cDNA文库或基因组文库。
(2)利用基因数据库筛选指定例如编码特异于植物的胁迫耐受性基因例如来源于拟南芥的DREB基因(DREB1A基因，DREB1B基因，DREB1C基因，DREB2A基因，DREB2B基因)的转录因子的已知基因的重要序列(高度保守区域或推测具有需要的功能的区域)。随后，基于该特定的序列，进行现存的基因数据库的同源性检索。检索的遗传数据库可以是EST或全长基因。利用分析软件例如BLAST或FASTA在GenBank或DDBJ数据库进行同源性检索。优选的是，检测的目标是编码氨基酸序列的基因，该氨基酸序列尤其是与高度保守区域或推测具有需要的功能的区域的氨基酸序列具有高同源性，结果获得保存了对一个蛋白质的功能必需的氨基酸序列的序列。基于获得的序列，设计引物，利用未克隆的cDNA(RT-PCR)，一个cDNA文库，基因组DNA，或基因组文库作为模板进行PCR，从而获得需要的基因。或者，由PCR扩增的DNA片段用作为探针，对cDNA文库或基因组文库进行筛选以获得需要的基因。
(3)核苷酸序列的测定根据常规方法可以测定克隆的cDNA的整个核苷酸序列。核苷酸测序包括利用M13噬菌体的Maxam-Gilbert的化学修饰方法或双脱氧核苷酸链终止方法。通常，利用自动核苷酸测序仪(例如，377DNA测序仪，Pekin-Elmer)进行测序。
因此，鉴定OsDREB1A(SEQ ID NO1)，OsDREB1B(SEQ ID NO3)，OsDREB1C(SEQ ID NO5)，OsDREB1D(SEQ ID NO7)，和OsDREB2A(SEQ IDNO9)为来源于水稻的DREB同源基因。
还有，通过对该基因的ORFs进行分析而鉴定由这些基因编码的OsDREB1A蛋白质(SEQ ID NO2)，OsDREB1B蛋白质(SEQ ID NO4)，OsDREB1C蛋白质(SEQ ID NO6)，OsDREB1D蛋白质(SEQ ID NO8)，和OsDREB2A蛋白质(SEQ ID NO10)。
但是，本发明的基因不限于包括显示于SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ IDNO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9的DNA的基因。包括在严格条件下与包括一个核苷酸序列杂交的DNA的基因也是本发明的基因，只要它们编码调节位于胁迫反应元件的下游的基因的转录的蛋白质，所述的核苷酸序列与包括显示于SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7，或SEQ ID NO9的核苷酸序列的DNA互补。“严格条件”是指其中甲酰胺浓度是30-50％，温度是37℃到50℃，以及6×SSC的条件。优选的是，甲酰胺浓度是50％，温度是42℃，并且6×SSC。
本发明的基因是编码包括显示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10的氨基酸序列的蛋白质的基因。即使一个蛋白质包含在显示于SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸序列的缺失、取代、或添加的氨基酸序列，编码这些蛋白质的基因也包括在本发明的基因中，只要这些蛋白质可以调节位于胁迫反应元件的下游的基因的转录。术语“几个氨基酸”优选的是指20个或更少和更优选的是5个或更少的氨基酸。
采用常规技术例如Kunkel方法，有空位的双链体方法或其变异体，利用突变导入试剂盒[例如Mutant-K(Takara)或Mutant-G(Takara)]或利用LAPCR体外诱变系列试剂盒(Takara)可以将突变导入到本发明的基因，所述的突变导入试剂盒利用位点特异性诱变。
一旦已经测定本发明基因的核苷酸序列，通过化学合成，通过利用基因的cDNA或基因组DNA作为模板的PCR，或通过以具有上述核苷酸序列的DNA片段作为探针的杂交可以获得本发明基因。
2.本发明蛋白质的DRE结合能力和转录激活能力的分析(1)DRE结合能力的分析通过凝胶迁移分析(Urao，T.等人，植物细胞51529-1539(1993))，利用由蛋白质，GST等等组成的融合蛋白质证实本发明的蛋白质结合到DRE的能力。以两个基因的阅读框架互相相合的方式将本发明的基因连接到编码GST基因(例如，pGEX-4T-1载体)的质粒的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码区域的下游，在诱导融合蛋白质合成的条件下培养已经转化了质粒的大肠杆菌，从转化的大肠杆菌纯化融合蛋白可以制备本发明的蛋白质。
凝胶迁移分析是检测DNA和蛋白质相互作用的方法。将用32P标记的含有DRE的DNA片段等等与上文所述的融合蛋白混合，并且培养，获得的混合物进行电泳。在干燥之后，将凝胶进行放射自显影以检测由于DNA片段和蛋白质的结合已经迁移到背面的带。由于当使用含有突变的DRE序列的DNA片段时，没有检测到上述介绍的带，可以证明本发明蛋白质与DRE序列的特异性结合。
(2)转录激活能力的分析通过利用水稻原生质体系统的反式激活试验可以分析本发明蛋白质的转录激活能力。例如，将OsDREB1A cDNA连接到含有CaMV35S启动子的pBI221质粒(Clontech)以构建效应子质粒。另一方面，将含有DRE的DNA片段连接到TATA启动子的上游以构建报道质粒，所述的启动子位于β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的上游。结果，将这两个质粒导入到水稻原生质体并且然后测定GUS活性。如果通过OsDREB1A蛋白质的同时表达GUS活性得到增强，则可以知道原生质体中OsDREB1A蛋白质的表达激活了通过DRE序列的转录。
在本发明中，根据Abel等人的方法(Abel，S等人，植物杂志5421-427(1994))可以制备原生质体和将质粒DNA导入到原生质体。为了将质粒DNA导入效率不同的实验错误降低到最小，可以将其中的荧光素酶基因被连接到CaMV35S启动子的下游的质粒与上述两个质粒一起导入到原生质体，因此可以测定抗荧光素酶活性的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性。然后，获得的测定值显示转录激活能力。采用Jefferson等人的方法可测定β-葡萄糖醛酸酶的活性(Jefferson，R.A等人，EMBO J。838447-8451(1986))；利用PicaGene荧光素酶分析试剂盒(Toyo InK)可以测定荧光素酶活性。
3.重组载体和转化体的制备(1)重组载体的制备通过将本发明的基因连接到(插入到)合适的载体可以获得本发明的重组载体。待插入本发明基因的载体没有特别的限制，只要它在宿主中可复制。例如，可以使用质粒DNA，噬菌体DNA等。质粒DNA包括用于大肠杆菌宿主的质粒例如pBR322，pBR325，pUC118，和pUC119；枯草芽孢杆菌宿主的质粒pUB110，pTP5；酵母宿主的质粒例如YEp13，YEp24，和YCp50；用于植物细胞宿主的pBI221和pBI121。噬菌体DNA包括λ噬菌体等等。再者，动物病毒载体例如反转录病毒或痘苗病毒；或也可以使用昆虫病毒载体例如杆状病毒。
为了将本发明的基因插入到载体，例如可以使用一种方法，其中用合适的限制性酶裂解纯化的DNA，然后插入到限制性位点或用于连接到载体的合适的载体DNA的多克隆位点。应该以该基因的功能可表达的方式将本发明的基因插入到载体。为了达到该目的，除了启动子和本发明的基因，如果需要，可以将含有顺式元件的那些例如加强子，剪接信号，多聚(A)附加信号，选择标记，核糖体结合序列(SD序列)等等连接到本发明的载体。选择标记的例子是二氢叶酸还原酶基因，氨苄青霉素耐受基因，新霉素耐受基因等等。
(2)转化体的制备通过将本发明的重组载体导入到宿主以使需要的基因表达，可以获得本发明的转化体。对宿主没有特别的限制，只要本发明的基因能够在其中表达。特定宿主的例子包括埃希氏细菌例如大肠杆菌；芽孢杆菌例如枯草芽孢杆菌；假单胞菌例如粪假单胞菌；根瘤菌例如苜蓿中华根瘤菌；酵母例如啤酒酵母，粟酒裂殖酵母；从拟南芥，玉米，水稻，胡萝卜等等建立的植物细胞系，或从例如植物制备的原生质体；动物细胞例如COS细胞，CHO细胞；或昆虫细胞例如Sf9细胞和Sf21细胞。
当将细菌例如大肠杆菌用作为宿主时，本发明的重组载体能够在宿主内自主复制，同时，优选的是它由启动子，核糖体结合序列，本发明的基因，和转录终止序列组成。该载体还含有调节该启动子的基因。也可以使用大肠杆菌菌株例如HMS174(DE3)，K12，或DH1。可以使用枯草芽孢杆菌菌株MI114或207-21。
可以使用任何启动子，只要能够指导所需要的基因在宿主例如大肠杆菌中表达。例如，也可以使用大肠杆菌或噬菌体来源的启动子例如trp启动子，lac启动子，PL启动子，或PR启动子。还可以使用人工设计和改变的启动子例如tac启动子。对将重组载体导入到细菌的方法没有特别的限制，其例子包括利用钙离子的方法(Cohen，S.N.等人，美国科学院学报，692110-2114(1972))和电穿孔方法。
当以酵母例如啤酒酵母，粟酒裂殖酵母，或巴斯德毕赤氏酵母用作为宿主时，对启动子没有特别限制，可以使用任何启动子，只要能够指导需要的基因在酵母中的表达。例如可以使用gal1启动子，gal10启动子，热休克蛋白质启动子，MFα1启动子，PH05启动子，PGK启动子，GAP启动子，ADH启动子或AOX1启动子。
对将重组载体导入到酵母的方法没有特别限制，其例子包括电穿孔(Becker，D.M.等人，酶学方法，194182-187(1990))，原生质体方法(Hinnen，A等人，美国科学院年报，751929-1933(1978))，乙酸锂方法(Itoh，H.细菌杂志，153163-168(1983))。
当以植物细胞例如从水稻，玉米，小麦，拟南芥，烟草，胡萝卜等等建立的细胞株或从这样的植物制备的原生质体，用作为宿主时，对启动子没有特别的限制，只要能够指导需要的基因在植物中表达。例子包括椰菜花叶病毒的35SRNA启动子，rd29A基因的启动子，rbcS启动子。
将重组载体导入到植物中的方法包括Abel等人利用聚乙二醇(Abel，H.等人，植物杂志5421-427(1994))的方法和电穿孔。当将动物细胞用作为宿主时，例如，可以使用猿COS-7或Vero细胞，中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)，小鼠L细胞，大鼠GH3细胞，人FL细胞等等，SRα启动子，SV40启动子，LTR启动子，CMV启动子等等。还可以使用人巨细胞病毒等等的早期基因启动子。
为了将重组载体导入到动物细胞，例如，可以使用电穿孔，磷酸钙方法，脂转染等等。当昆虫细胞例如Sf9细胞，Sf21细胞等等用作为宿主时，可以使用磷酸钙方法，脂转染，电穿孔等等。
4.本发明的蛋白质的生产本发明的蛋白质是具有由本发明的基因编码的氨基酸序列的蛋白质；或是具有在上面描述的氨基酸序列中有至少一个氨基酸突变的氨基酸序列并且调节位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质。
通过将转化体在培养基中培养和从获得的培养产物中回收蛋白质可以获得本发明的蛋白质。术语“培养产物”是指任何下列材料培养物上清液，培养的细胞，培养的微生物，或破碎的细胞或微生物。采用用于培养宿主的常规方法可以在培养基中培养转化体。
作为用于培养从微生物宿主例如大肠杆菌或酵母获得的转化体的培养基，可以使用天然的或合成的培养基，只要它含有被微生物同化的碳源，氮源和无机盐并能够有效培养转化体。当将植物细胞用作为宿主，如果必要可以在培养基中加入维生素例如硫胺和维生素B6。当将动物细胞用作为宿主时，如果必要可以向培养基中加入血清RPMI1640。
碳源的例子包括碳水化合物例如葡萄糖，果糖，蔗糖和淀粉；有机酸例如乙酸和丙酸；和醇例如乙醇和丙醇。氮源的例子包括氨；无机或有机酸的铵盐例如氯化铵；硫酸铵，乙酸铵和磷酸铵；其他含有氮的化合物；胨；肉提取物；和玉米浸提物。
无机物质的例子包括磷酸一钾，磷酸二钾，磷酸镁，硫酸镁，氯化钠，硫酸铁(I)，硫酸镁，硫酸铜和碳酸钙。通常，在需氧条件下(例如振荡培养或通气搅拌培养)，在30-37℃，约6小时到3天进行培养。在培养期间，pH保持在约7.0-7.5。用无机或有机酸，碱溶液等等调节pH。
在培养期间，如果必要向培养基中抗生素例如氨苄青霉素或四环素。当培养用含有诱导型启动子的表达载体转化的微生物时，如果必要向培养基中加入诱导剂。例如，当培养用含有Lac启动子的表达载体转化的微生物时，可以在培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等等。当培养用含有trp启动子的表达载体转化微生物时，可以向培养基中加入吲哚丙烯酸(IAA)等等。
通常，在5％二氧化碳存在下，约30-37℃将培养进行约6小时-3天。在培养期间，如果需要可以向培养基中加入抗生素例如卡那霉素或青霉素。在培养之后，如果蛋白质在微生物或细胞中产生，通过将培养的微生物或细胞破碎而提取本发明的蛋白质。如果本发明的蛋白质被分泌到微生物或细胞的外面，可以在随后的步骤中使用培养液，将它离心以去除微生物或细胞。之后，可以单独或合适的方式结合使用用于分离/纯化蛋白质的常规生化技术例如硫酸铵沉淀，凝胶层析，离子交换层析，和亲和层析以从上面的培养产物中分离和纯化本发明蛋白质。
5.制备已经导入了本发明的基因的转基因植物通过利用遗传工程技术将编码本发明的蛋白质的基因导入到宿主植物可以生产耐受环境胁迫，特别是低温，冷冻和脱水胁迫的转基因植物。将本发明的基因导入到宿主植物的方法包括间接导入例如农杆菌感染方法和直接导入例如粒子枪方法，聚乙二醇方法，脂质体方法，和微注射方法。当使用农杆菌感染方法时，采用下列步骤可以生产本发明的转基因植物。
(1)导入到植物的重组载体的制备和农杆菌转化通过用合适的限制酶裂解包括本发明基因的DNA，如果必要将合适的接头连接到获得的DNA，将该DNA插入到用于植物细胞宿主的克隆载体，可以制备待导入到植物的重组载体。二元载体型质粒例如pBI2113Not，pBI2113，pBI101，pBI121，pGA482，pGAH，pBIG，或中间载体型质粒例如pLGV23Neo，pNCAT，pMON200可以用作为克隆载体。
当使用二元载体型质粒时，在二元载体的边界序列(LB，RB)之间插入需要的基因。在大肠杆菌中扩增获得的重组载体。然后通过冻融，电穿孔等等将扩增的重组载体导入到根癌农杆菌C58，LBA4404，EHA101，C58C1RifR，EHA105等等。将获得的农杆菌用作为植物的转化。
在本发明中，除了上面描述的方法还可以使用三成员偶合方去(Nucleic acidsresearch 128711(1984))以制备含有本发明基因的质粒的农杆菌以感染植物。具体地，将含有本发明基因的质粒的大肠杆菌，含有辅助质粒的大肠杆菌(例如pRK2013)，和农杆菌混合，在含有利福平和卡那霉素的培养基上培养，因此，可以获得用于感染植物的合子农杆菌。
对于外源基因等在植物体中表达，应该将用于植物的启动子和终止子分别定位于结构基因的上游和下游。可以用于本发明的启动子的特定例子包括椰菜花叶病毒(CaMV)来源的35S转录体(Jefferson，RA.等人，EMBO J 63901-3907(1987))；用于玉米泛素基因的启动子[Christensen，A.H.等人，Plant Mol.Biol.18675-689(1992)]，胭脂碱合成酶(NOS)基因的启动子；章鱼碱(OCT)合成酶基因的启动子。可用的终止子的特定例子包括CaMV衍生的终止子和NOS衍生的终止子。不限于上面所述的启动子和终止子，只要已知它们在植物体中有功能。
如果用于转基因植物的启动子是对需要的基因的组成型表达负责的启动子(例如CaMV35S启动子)，其使用已经引起转基因植物的生长的延迟，可以使用指导需要的基因的瞬时表达的启动子(例如rd29A基因启动子)。如果需要，增强本发明基因的表达的内含子序列可以定位于启动子序列和基因之间。例如，可以导入来自于玉米醇脱水酶(Adhl)的内含子(Genes&Development 11183-1200(1987))。
为了有效地选择需要的转化的细胞，优选的是将有效的选择标记基因与本发明的基因结合使用。作为选择标记，可以使用从卡那霉素抗性(NPTII)基因，授予植物对抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(htp)基因，授予植物bialaphos耐受性的膦丝菌素酰基转移酶(bar)基因等等选择的一个或多个基因。可以将本发明的基因和选择标记基因一起掺入单一载体。或者，可以使用掺入到各自的载体的两种类型的重组DNA。
(2)将本发明的基因导入到宿主在本发明中，尽管对转化体的宿主没有特别限制，优选的是植物。植物可以是培养的植物细胞，培养的植物的整个植物体，植物器官(例如叶，花瓣，茎，根，根茎或种子)，或植物组织(例如表皮，韧皮部，薄壁组织，木质部，或维管束)。优选的植物是单子叶植物例如水稻，玉米和小麦。当培养的植物细胞，植物体，植物器官或植物组织用作为宿主时，可以使用农杆菌感染方法，粒子枪方法，或聚乙二醇方法，通过将该载体导入到植物部分可以将编码本发明蛋白质的DNA导入，以转化该宿主。或者，通过电穿孔将载体导入到原生质体以产生转化的植物。
例如，当采用农杆菌感染方法将基因导入到拟南芥时，用含有包括需要的基因的质粒的农杆菌感染植物的步骤是必须。该步骤可通过真空抽滤方法(CRAcad.Sci.Paris，life Science，3161194(1993))进行。具体地，使拟南芥在由等部分的蛭石和珍珠岩组成的土壤上生长。将拟南芥直接浸入含有包括本发明基因的质粒的农杆菌培养液中，置于干燥器，然后用真空泵抽吸到65-70mmHg。然后将植物保持在室温5-10分钟。将植物罐转移到用外膜覆盖以保持湿度的盘。接下来的一天，移走外膜。将植物在那种状态下生长以收获种子。
此后，将种子播种在补充了合适的抗生素的MS琼脂培养基上以选择那些具有本发明基因的个体。将在该培养基上生长的拟南芥转移到罐并且在那里生长。结果，可以获得已经导入了本发明基因的转基因植物的种子。通常，以类似的方式将基因导入到宿主植物的基因组。但是，由于在已经导入了基因的基因组的具体位置不同，导入的基因的表达不同。这种现象被称为“位置效应”。通过用来自于导入的基因的DNA片段作为探针，进行Northern印迹分析对转化体测试，选择更高效表达的导入基因的转化体是可能的。
通过从这些植物的细胞和组织提取DNA和通过PCR或Southern印迹分析检测导入的基因可以证明，需要的基因整合到了导入本发明的基因的转基因植物及其后代，这些是本领域内常规使用的方法。
(3)本发明基因在植物组织中的表达水平和表达位点的分析通过从植物的细胞和组织中提取RNA和通过RT-PCR或Northern印迹分析检测导入的基因的mRNA，可以分析已经导入了本发明基因的转基因植物中一个基因的表达水平和表达位点，这些是本领域内常规技术。或者，利用抗上面产物的抗体，通过Western印迹分析等等可以直接分析本发明基因产物的表达水平和表达位点。
(4)在已经导入了本发明基因的转基因植物中各种基因的mRNA水平的变化可以通过Northern杂交在已经导入了本发明基因的转基因植物中鉴别那些据信由于转录因子的作用而导致表达水平被改变了基因。
例如，在特定的时间期间内(例如1-2星期)使水栽或其它方式生长的植物遭受环境胁迫。环境胁迫的例子包括低温，脱水，和盐胁迫。例如，通过从水栽培养基中拔出植物，在滤纸上干燥10分钟到24小时可以给予脱水胁迫。通过在15到-4℃保留植物10分钟到24小时可以给予低温胁迫。通过例如用50-500mM氯化钠溶液替代水栽溶液并且使植物保留10分钟到24小时可以给予盐胁迫。
分别从没有遭受胁迫的对照植物，从遭受了环境胁迫植物制备总RNA，将获得的总RNA进行电泳。通过利用待观察的基因作为探针进行RNA杂交可以分析表达方式。(5)转基因植物对环境胁迫的耐受性的评价通过将转基因植物置于含有包括蛭石和珍珠岩等等的土壤的罐中，将植物与各种环境胁迫接触，检测转基因植物的存活力可以评价已经导入了本发明基因的转基因植物的环境胁迫耐受性。环境胁迫包括低温，脱水和盐胁迫。例如，通过在不加水时保持植物2-4星期，然后检测存活力可以评价对脱水胁迫的耐受性。通过将植物在15到-10℃保持1-10天，在20-35℃生长2天到3星期，然后检测其存活力，可以评价对低温和冷冻胁迫的耐受性。可以例如通过将植物保留在100到600毫摩尔/升的NaCl中1小时到7天，在20到35℃下生长1到3星期，然后检测它的存活率来评定其对盐胁迫的耐受性。
6.确定植物中的胁迫水平本发明的基因的转录是低温胁迫，脱水胁迫或盐胁迫激活的。所以，本发明的基因的转录水平的确定能够用于评价植物遭受的低温，脱水或盐胁迫的胁迫水平。
本发明的基因的转录水平可以例如通过RNA凝胶印迹分析或定量PCR来确定。用于RNA凝胶印迹分析的探针可以根据基于本发明的基因和/或含有与该基因邻接的特异序列的100-1000bp区的任何常规方法来生产。用于定量PCR的引物可以通过基于编码本发明的基因的区域或与其邻接的区域的序列的任何常规方法来制备。
上面所述的探针或引物可以用于试剂盒中用于确定本发明的基因的转录水平。
7.其他另外，本发明的蛋白质可以用于生产抗该蛋白质的抗体。该抗体可以是多克隆或多克隆抗体。生产抗体的方法是没有特定限制的。并且可以根据任何常规方法来进行[参见例如，Sambrook，J et al.，分子克隆，冷泉港实验室出版(1989)]。该抗体可以用于通过例如Western印迹或免疫沉淀检测需要的该蛋白质。
实施例参考下面的实施例本发明得到了更详细的说明，但是，本发明的范围不限于这些实施例。
筛选水稻OsDREB基因1.用数据库进行同源性研究在下面所示的DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A和DREB2B基因的全长氨基酸序列的基础上，用GenBank中的水稻DNA的数据库的BLAST进行同源性检索。
作为结果，发现了四个类型的基因来自EST数据的1型(OsDREB1B)，来自根据DREB1同源基因的基因组序列数据的2型(OsDREB1C和OsDREB1D)，和来自根据DREB2同源基因的EST数据的1型(OsDREB2A)。
2.cDNA文库的检索(1)制备cDNA文库在黑暗条件下，用蒸馏水，在25℃，将水稻种子(Nipponbare)水栽生长15天。将得到的植物体在4℃下处理2小时或24小时，从培养器中拔出，在滤纸上干燥10小时，或用250mM的NaCl处理10小时，接着用液氮冷冻。用硫氰酸胍-氯化铯方法从冷冻的样品中提取总RNA，用Oligo(dt)-纤维素柱制备mRNA。用得到的mRNA作为模板和用HybriZAP-2，1双杂交cDNA Gigapack克隆试剂盒(Stratagene)合成cDNA，将cDNA插入和克隆进HybriZAP-2，1噬菌粒载体的EcoRI-XhoI裂解位点。用GigapackIII金包装提取物(Stratagene)包装噬菌粒的DNA。将得到的含有cDNA的λ噬菌体颗粒用于感染寄主大肠杆菌，然后，扩增，随后回收。然后储存得到的噬菌体悬浮液。
(2)利用探针检索通过PCR扩增(1)中得到的OsDREB1D基因组序列的N末端侧的含有ERF/AP2区和一个保守区的序列，生产探针。利用这一探针检索(1)中制备的cDNA文库。作为结果，得到新的DREB1同源cDNA(OsDREB1A)。
通过水稻基因组研究课题提供对应于OsDREB1B的EST克隆。为了扩增全长的蛋白质编码区，利用根据从转录起始位点的基因组序列和终止密码子得到的预测所设计的引物将OsDREB1C和OsDREB1D进行PCR。
根据EST的序列生产用于检索OsDREB2A的全长cDNA的探针，从而检索cDNA文库。由于推测得到的cDNA克隆是不完全长度的，所以利用从cDNA文库制备的DNA作为模板进行5’RACE确定全长序列。根据这一序列，设计用于扩增全长基因的引物，并且通过RT-PCR得到全长基因。
(3)核苷酸测序利用377 DNA序列仪(Perkin-Elmer)确定得到的DREB同源基因的cDNA的核苷酸序列。另外，分析OPF确定所有氨基酸序列。结果作为结果，鉴定5种类型的OsDREB基因和对应于OsDREB蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列。作为来源于拟南芥的DREB蛋白质，所有OsDREB蛋白质含有推测为中心的ERF/AP2 DNA结合区，N末端的核定位信号，和C末端的酸激活区的这些区域(

图1)。
在图2和图3中，将来自各种植物的DREB同源蛋白质的氨基酸序列相互比较，发现了高度保守序列。在带色的背景上标出的字母代表高保守区。
每个OsDREB的核苷酸序列和氨基酸序列的序列号如下OsDREB1A核苷酸序列(SEQ ID NO1)，氨基酸序列(SEQ ID NO2)；OsDREB1B核苷酸序列(SEQ ID NO3)，氨基酸序列(SEQ ID NO4)；OsDREB1C核苷酸序列(SEQ ID NO5)，氨基酸序列(SEQ ID NO6)；OsDREB1D核苷酸序列(SEQ ID NO7)，氨基酸序列(SEQ ID NO8)；OsDREB2A核苷酸序列(SEQ ID NO9)，氨基酸序列(SEQ ID NO10)。[实施例2]OsDREB蛋白质结合DRE的能力的分析利用大肠杆菌制备谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和OsDREB1A和OsDREB2A的蛋白质之间的融合蛋白质。然后通过凝胶移动试验评估得到的蛋白质，以检测蛋白质与DRE的结合能力。
通过PCR扩增定位于OsDREB1A cDNA的核苷酸序列的位置69到位置545的477bp的DNA片段或定位于OsDREB2A cDNA的核苷酸序列的位置334到位置822的489bp的DNA片段。然后，将扩增片段连接到质粒pGEX-4T-1(Pharmacia)的EcoRI-XhoI位点。在将这一质粒导入大肠杆菌XL1-BlueMRF中后，在500毫升的2x YT培养基中培养大肠杆菌(分子克隆(1982)，冷泉港实验室出版)。在这一培养物中，加入激活质粒PGEX-4T-1的启动子的0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，以诱导OsDREB1A和GST的融合蛋白质的合成。
在18毫升缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM EDTA，5mMMgCl2，400mMNaCl，5％甘油，0.1mM苯甲磺酰氟，0.1mM二硫苏糖醇)中悬浮已经诱导该蛋白质的大肠杆菌。然后，在其中加入1％Triton X-100和1mM EDTA。用超声波裂解细胞后，在20,000g离心裂解的物质1小时。然后，利用谷胱甘肽-琼脂糖(Pharmacia)从上清液中纯化蛋白质。利用32P标记的含有DRE序列的75bpDNA片段(SEQ ID NO16)作为探针，在室温下温育得到的融合蛋白质20分钟。用含有0.25x Tris-硼酸-EDTA的5％的聚丙烯酰胺，在120V下电泳混合物90分钟。作为这一凝胶移动试验的结果，检测那些移动到背面的带。当利用含有突变的DRE序列的DNA片段作为探针时，没有检测到这些带。所以，表明OsDREB1A和OsDREB2A蛋白质特异地结合DRE序列(图4)。
制备转化体(转基因植物)(1)构建植物质粒1)制备OsDREB1A基因片段利用下面的引物通过PCR扩增定位于OsDREB1A基因的cDNA的核苷酸序列的位置69到位置785的717bp的DNA片段。然后，将扩增的片段连接到载体pBluescriptSK(-)(Stratagene)的BamHI裂解位点，得到重组的质粒pSKOsDREB1A。用BamHI裂解pSKOsDREB1A得到含有OsDREB1A基因的约700bp的DNA片段。正向；5’-GGGGATCCATGTGCGGGATCAGCAGGAGATG-3’(SEQ IDNO17)反向5’-GGGGATCCCTAGTAGCTCCAGAGTGGGAC-3’(SEQ ID NO18)2)制备PBE2113Not，G-ubi，G35S-ShΔ将PBE2113Not(植物细胞101391-1406(1998))，G-ubi，和G35S-ShΔ用作具有启动子DNA的质粒。G-ubi和G35S-ShΔ制备如下。开始时，用BamHI裂解pBIG质粒(核酸研究18203(1990))，再末端钝化和连接来去除BamHI裂解位点。然后，用HindIII和EcoRI裂解质粒。将得到的片段与通过以相同方式裂解PBE2113Not质粒得到的约1.2kb的片段相互连接，从而制备pBIG2113Not质粒。
随后，用HindIII和BamHI裂解pBIG2113Not，然后与同样方法裂解的rd29A启动子的片段(约0.9kb，自然生物技术17287-291(1999))的片段连接，制备pBIG29APHSNot质粒。另外，用HindIII和SalI裂解这一pBIG29APHSNot质粒，然后与同样方法裂解的玉米泛素基因(Ubi-1)启动子(约2.0kb，植物分子生物学18675-689(1992))的片段，或含有p35S-shΔ-stop的CaMV 35S启动子和玉米的蔗糖合成酶基因(Sh1)内含子的一部分的片段(约1.6kb，ProceedingNational Academy of Science USA 9615348-15353(1999))连接。这样，制备了G-ubi质粒或G35S-shΔ质粒。分别用BamHI裂解上面所述的PBE2113Not，G-ubi，和G35S-shΔ，用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd)将其与OsDREB1A基因片段连接。用这样得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α。在培养该转化体后，分别从中纯化质粒pBE35SOsDREB1A，G-ubiOsDREB1A，和G35S-ShΔOsDREB1A。然后，确定它们的核苷酸序列，选择具有以有意义方向结合的OsDREB1A基因的那些核苷酸。
3)导入农杆菌将含有质粒pBE35SOsDREB1A的大肠杆菌DH5α，含有辅助质粒pRK2013的大肠杆菌HB101，和农杆菌C58混合，并且在28℃，在LB琼脂培养基上培养24小时。刮去产生的菌落，并且悬浮于1毫升的LB培养基中。在含有100毫克/升利福平和20毫克/升的卡那霉素的LB琼脂培养基上铺被该悬浮液(10微升)，在28℃下培养2天，从而得到合子农杆菌C58(pBE35SOsDREB1A)。通过电穿孔，分别将质粒G-ubiOsDREB1A和质粒G35S-ShΔOsDREB1A导入农杆菌EHA105，然后在培养后，用10％的甘油洗涤。这样制备了农杆菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和农杆菌EHA105(G35S-shΔOsDREB1A)。
(2)通过农杆菌感染将基因导入拟南芥在含有100毫克/升的利福平和20毫克/升的卡那霉素的10毫升LB培养基中，在28℃培养合子24小时。随后，在500毫升的LB培养基中加入培养液，并且培养24小时。离心得到的培养液以除去培养基，悬浮于500毫升的感染缓冲液(每升2.3g Murashige和Skoog植物盐混合物(Nihon PharmaceuticalCo.，Ltd)，1毫升Gamborg维生素溶液，50g蔗糖，200微升L-77(Nippon UnicarCo.，Ltd.)，和10微克6-苄氨基嘌呤)。
在另一方面，在含有等量的蛭石和珍珠岩组成的土壤的9cm的罐中生长4到5个拟南芥植物体6星期。然后，将拟南芥植物体直接浸入农杆菌C58(pBI35SOsDREB1A)的农杆菌悬浮液中，放置于干燥器中，用真空泵抽吸，将压力减小到650mmHg，然后停留10分钟。随后，将植物罐转移到盘中，用包布覆盖维持湿度。在第二天，除去包布。然后，不覆盖生长植物以便产生种子。在次氯酸钠的水溶液中灭菌后，在用于选择的琼脂培养基(用100毫克/升的万古霉素和30毫克/升的卡那霉素补充的MS培养基)上播种种子。将在这一培养基上生长的拟南芥转移到罐中，得到转化植物的种子。
(3)通过农杆菌感染，将基因导入水稻在70％的乙醇中浸泡水稻种子1分钟，在2％的次氯酸钠中浸泡灭菌1小时。然后，用无菌水洗涤已灭菌的种子，将各9粒种子播种在N6D固体培养基(每升3.98g的CHU[N6]基础盐混合物(Sigma)，30g蔗糖，100毫克肌醇，300毫克酪蛋白氨基酸，2.878毫克的L-脯氨酸，2毫克的甘氨酸，0.5毫克的烟酸，0.5毫克的盐酸吡哆醇，1毫克的盐酸硫胺素，2毫克的2，4-D，4克的Gellite，pH5.8)，接着培养24天。这样诱导了愈伤组织。将从约20粒种子形成的愈伤组织转移到新的N6D固体培养基上，接着再培养3天。
在28℃，在含有100毫克/升的利福平和20毫克/升的卡那霉素的5毫升YEP培养基(每升10克细菌培养用蛋白胨，10克细菌培养用酵母提取物，5克NaCl，和406毫克MgCl2.6H2O，pH7.2)中分别培养农杆菌EHA105(G-ubiOsDREB1A)和农杆菌EHA105(G35S-ShDOsDREB1A)24小时。用含有20毫克/升乙酰丁香酮的AAM培养基稀释该农杆菌，直到O.D.660是0.1，每升培养基中含有10毫克MnSO4.5H2O，3mgH3BO3，2mg ZnSO4.7H2O，250微克Na2MoO4.2H2O，25微克CuSO4.5H2O，25微克CoCl2.6H2O，750微克KI，150毫克CaCl2.2H2O，250mgMgSO4.7H2O，40mg Fe-EDTA，150mg NaH2PO4.2H2O，1mg烟酸，10毫克盐酸硫胺素，1毫克盐酸吡哆醇，100毫克肌醇，176.7毫克L-精氨酸，7.5毫克甘氨酸，900毫克L-谷氨酸，300毫克天冬氨酸，和3克KCl，pH5.2。这样制备了20毫升农杆菌悬浮液。
随后，将农杆菌悬浮液加入培养了3天的愈伤组织，然后，混合1分钟。然后，将该愈伤组织放置于无菌的纸巾上除去过多的农杆菌悬浮液，然后在暗处，在25℃，在放置了无菌滤纸的2N6-AS固体培养基(每升3.98g CHU[N6]基本盐混合物，30克蔗糖，10克葡萄糖，100毫克肌醇，300毫克酪蛋白氨基酸，2毫克甘氨酸，0.5毫克尼克酸，0.5毫克盐酸吡哆醇，1毫克盐酸硫胺素，2毫克2，4-D，10毫克乙酰丁香酮，和4克Gellite，pH5.2)上培养3天。在培养3天后，用含有500毫克/升的羧苄青霉素的3％的蔗糖水溶液完全洗涤培养产物直到产物不变白。进一步在含有500毫克/升的羧苄青霉素和10毫克/升潮霉素的N6D固体培养基上培养洗涤的培养产物1星期。然后，将得到的培养产物转移到含有500毫克/升的羧苄青霉素和50毫克/升的潮霉素的N6D固体培养基上，培养18天。另外，将愈伤组织转移到再生培养基(每升4.6克Murashige和Skoog植物盐混合物(Nihon Pharemaceutical Co.，Ltd)，30克蔗糖，30克山梨醇，2克酪蛋白氨基酸，100毫克肌醇，2毫克甘氨酸，0.5毫克烟酸，0.5毫克盐酸吡哆醇，0.1毫克盐酸硫胺素，0.2毫克NAA，2毫克细胞分裂素，250毫克羧苄青霉素，50毫克潮霉素，和8克琼脂糖，pH5.8)。将该产物每星期转移到新的培养基中再生。将生长到约1cm的具有芽的愈伤组织转移到无激素的培养基(每升4.6克Murashige和Skoog植物盐混合物(Nihon药物公司)，30克蔗糖，2毫克甘氨酸，0.5毫克烟酸，0.5毫克盐酸吡哆醇，0.1毫克盐酸硫胺素，50毫克潮霉素，和2.5克Gellite，pH5.8)。在无激素培养基上已经生长到约8厘米的植物体转移到含有合成的特殊装罐土壤(Bonsol No.1，SumitomoChemical Co.，Ltd.)的罐中允许转基因植物产生种子。
利用水稻原生质体分析转录激活机制正如图5所示，为了构建效应质粒，将OsDREB1A cDNA，OsDREB2A cDNA，DREB1A cDNA，和DREB2A cDNA放置于CaMV35S启动子和玉米的蔗糖合成酶的内含子序列的下游，与pBI221质粒(Clontech)连接。独立地构建报道质粒，该质粒中，在最小启动子-61rd29A和GUS报道基因的上游，含有rd-29A启动子的DRE的75bp DNA重复片段插入了两次。
随后，将这两个质粒导入水稻原生质体，然后，根据分解4-甲基7-羟基香豆酰-β-D-葡糖苷酸导致的荧光强度改变判断GUS活性。将CaMV35S启动子-LUC的融合基因作为每个实验的导入效率的标准同时导入。作为结果，发现OsDREB1A和OsDREB2A基因能通过DRE激活转录。
在转化体中，对OsDREB基因的表达的分析(1)在非转化体中分析OsSREB基因的表达通过Northern杂交分析野生型水稻中OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，和OsDREB2A基因的表达特性。在25℃，在白天16小时暴晒，晚上8小时的条件下水栽水稻17天。对植物体分别应用抗坏血酸，脱水，低温，盐(NaCl)，损伤和水胁迫。每0，10，20，40，60分钟，2，5，10和24小时对应用胁迫的水稻进行取样。
如下对水稻应用各种胁迫通过在含有100微摩尔ABA的溶液中浸泡应用抗坏血酸胁迫；通过在滤纸上干燥应用脱水胁迫；通过转移到冷却到4℃的培养箱应用低温胁迫；通过在含有250mM NaCl的水溶液中浸泡应用盐(NaCl)胁迫；通过将叶子切开8到10厘米高施加损伤胁迫；和通过浸泡纯水施加水胁迫。分别从没有给胁迫的对照植物和给胁迫的植物中制备总RNA。然后，将RNA进行电泳。这样，通过Northern方法观察每个基因的表达。结果表示在图6中。
从分析中可见，OsDREB1A基因的表达和OsDREB1B基因的表达分别主要是通过两个低温胁迫诱导的。相反，OsDREB2A的表达主要是通过脱水和盐胁迫诱导的。在OsDREB1C中连续观察到基因表达。
(2)在已转化的拟南芥中，OsDREB基因表达的分析以和实施例3相同的方法，制备具有导入拟南芥的OsDREB1A，OsDREB1D和OsDREB2A基因的转化体。通过Northern方法分析了导入转化体的OsDREB1A，OsDREB1D，和OsDREB2A基因的mRNA水平，和这些基因的水平，以及认为被导入基因改变的它们的表达。具体地，将rd29A基因，cor15a基因，kin1基因和erd10基因的部分片段用作探针(rd29ASEQ ID NO19，cor15aSEQ ID NO20，kin1SEQ ID NO21，erd10SEQ ID NO22)，分析了mRNA水平。除了转化体，将具有其中不含导入的DREB同源基因的pBI121质粒(Clontech)的已转化的拟南芥用作对照，比较基因表达。
将在GM琼脂培养基上生长3星期的约1克植物体暴露于脱水胁迫和低温胁迫。通过从琼脂培养基中拔出植物，并在石盘上干燥5小时而应用脱水胁迫。在4℃培养植物而应用低温胁迫5小时。分别从没有给予胁迫的对照植物和给予脱水和低温胁迫的植物制备总RNA。将得到的总RNA进行电泳。然后，通过Northern方法评估基因表达。
通常，以同样的方法将这些基因导入转化体的基因组，但由于基因组上的位置中的差异，从而使导入基因的表达不同。这一现象叫作“位置效应”。在这一实验中，通过Northern方法，用来自导入基因的DNA片段测试转化体，可以选择导入基因更高度表达的那些转化体。同样，通过利用可能参与胁迫耐受的基因的DNA片段作为探针，导入了OsDREBIA。这样，鉴定了具有各种mRNA水平的基因。结果表示在图7中。
作为结果，在启动子中具有GCCGAC的基因比具有ACCGAG的基因被更强地诱导。在单子叶植物的胁迫耐受基因的组中，具有GCCGAC作为DRE序列的那些的存在量比具有ACCGAG的那些更大。因此，这表明在这些单子叶植物中，OsDREB基因允许胁迫耐受基因比DREB基因更有效地表达。
(3)在已转化的水稻中分析OsDREB基因的表达以和实施例3同样的方法，制备具有导入水稻的拟南芥的OsDREB1A，OsDREB1B，和DREB1C基因的转化体。通过Northern方法分析导入转化体的拟南芥的OsDREB1A，OsDREB1B，和DREB1C基因的mRNA水平，和这些基因的水平，以及认为被导入基因所改变的它们的表达。具体地，将OsDREB1A基因，OsEREB1B基因，DREB1C基因，lip9基因，Wsi724基因，和SalT基因的部分片段用作探针(OsDREB 1ASEQ ID NO23，OsDREB 1BSEQ ID NO24，DREB1CSEQ ID NO25，LIP9SEQ ID NO26，Wsi724SEQ IDNO27，salTSEQ ID NO28)，分析mRNA的表达水平。在分析中，除了转化体，为了比较基因表达，将具有在其中不含导入的DREB同源基因的G-ubi的已转化水稻用作对照。
在含有30毫克/毫升潮霉素的0.1％的Benlate溶液中进行5天选择。然后，将植物转移到含有Bonsol No.1的罐中，生长12天。将约2克的生长植物应用盐(NaCl)和低温胁迫。通过从土壤中拔出植物体和浸泡在250mM NaCl的试管中5小时应用盐胁迫。在4℃培养植物体应用低温胁迫5小时。分别从没有给予胁迫的对照植物和给予盐和低温胁迫的植物制备总RNA，然后进行电泳。这样，以和(2)中同样的方法通过Northern方法观察每个基因的表达。在图8中表示了结果。
作为结果，在具有导入其中的OsDREB1A，OsDREB1B和DREB1C基因的已转化水稻中，诱导了在启动子区具有DRE序列的lip9基因的表达，而没有诱导启动子区中没有DRE序列的salT基因的表达。同样，在这些转化体中诱导了Wsi724基因的表达，该基因的表达在启动子区中没有鉴定，但根据应用胁迫时的表达方式(脱水、盐、低温可诱导，低温诱导比脱水和盐的诱导更慢)，推断它是OsDREB的靶。[实施例6]OsDREB基因对拟南芥胁迫耐受的影响以和实施例3相同的方式，制备具有导入拟南芥的OsDREB1A和DREB1A基因的转化体。作为对照，制备了用不含DREB同源基因的pBI121转化的拟南芥。在下面条件下进行各个耐受实验。
(1)NaCl耐受性如下观察NaCl耐受性。在GM培养基中生长拟南芥3星期，浸泡在600mMNaCl的水溶液中2小时，接着洗涤。然后，将植物体转移到含有Professional装罐土壤的罐中，培养3星期，评估它的存活率。
(2)脱水耐受性如下研究脱水耐受性。将生长在GM培养基中3星期的拟南芥转移到含有由等量的蛭石和珍珠岩组成的土壤的罐中，培养1星期，然后终止水供应。在培养2星期后，评估它的存活率。
(3)冷冻耐受性如下研究冷冻耐受性。将在GM培养基中生长3星期的拟南芥转移到含有Professional装罐土壤的罐中，培养1星期。然后，在-6℃放置植物体36小时，然后在22℃培养5天。然后评估它的存活率。
在观察盐胁迫耐受性的实验中，对照的存活率是12％，导入OsDREB1A的植物的存活率是55％或65％的。对于导入DREB1A的植物，导入35SDREB1A的植物存活率是68％，导入29ADREB1A的植物存活率是90％。这表明，在双子叶植物中OsDREB基因也提高了胁迫耐受性(图9)。
本文引证的所有申请，专利和专利申请书全部引入本文作为参考。
工业应用本发明提供了来源于单子叶植物的胁迫耐受转录因子，和编码这一转录因子的基因。利用本发明的该基因可以更有效地将胁迫耐受性传递给农作物，即单子叶植物。
序列表文字SEQ ID NO16；探针SEQ ID NO17；引物SEQ ID NO18；引物SEQ ID NO19；rd29a的探针SEQ ID NO20；cor15a的探针SEQ ID NO21；kin1的探针SEQ ID NO22；erd10的探针SEQ ID NO23；OsDREBIA的探针SEQ ID NO24；OsDREBIB的探针SEQ ID NO25；DREBIC的探针SEQ ID NO26；lip9的探针SEQ ID NO27；Wsi724的探针SEQ ID NO28；salT的探针序列表<110>日本国际农林水产业研究中心<120>编码植物转录因子的基因<130>PH-1628<150>JP 2001-358268<151>2001-11-22<160>28<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>927<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(69)..(782)<400>1cacactcgag cagagcaaat acagttcagg aatcaggagc aagcagaaac acacacacaa 60atccgaag atg tgc ggg atc aag cag gag atg agc ggc gag tcg tcg ggg 110Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly1 5 10tcg ccg tgc agc tcg gcg tcg gcg gag cgg cag cac cag acg gtg tgg158Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp15 20 25 30acg gcg ccg ccg aag agg ccg gcg ggg cgg acc aag ttc agg gag acg206Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr35 40 45agg cac ccg gtg ttc cgc ggc gtg cgg cgg agg ggc aat gcc ggg agg254Arg His Pro Val 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1.含有下面的DNA(a)或(b)的分离基因(a)含有如SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA；或(b)与包含一种核苷酸序列的DNA在严格条件下杂交，并且编码调节定位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质的DNA，其中所述核苷酸序列与含有SEQID NO1，SEQ ID NO3，SEQ ID NO5，SEQ ID NO7或SEQ ID NO9所示的核苷酸序列的DNA互补。
2.编码下面的蛋白质(c)或(d)的分离基因(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列的蛋白质；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且调节定位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的基因，其中胁迫是脱水胁迫，低温胁迫，或盐胁迫。
4.下面的重组蛋白质(c)或(d)(c)含有SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8或SEQID NO10所示的氨基酸序列的蛋白质；或(d)含有在SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，或SEQ ID NO10所示的氨基酸序列中具有一个或几个氨基酸缺失、取代、或添加的氨基酸序列，并且调节定位于胁迫反应元件的下游的基因转录的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其中胁迫是脱水胁迫，低温胁迫或盐胁迫。
6.含有根据权利要求1到3的任何一个所述的基因的重组载体。
7用权利要求6所述的重组载体转化的转化体。
8.据权利要求7所述的转化体，其中宿主是植物。
9.根据权利要求7所述的转化体，其中宿主是单子叶植物。
10.生产调节定位于胁迫反应元件下游的基因转录的蛋白质的方法，其中权利要求8或9所述的转化体培养在培养基中，并且从得到的培养产物中回收所述的蛋白质。
11.确定植物的胁迫水平的方法，其中确定植物体中权利要求1到3的任何一个所述的基因的转录水平。
12.通过在植物中导入权利要求1到3的任何一个所述的基因提高植物的胁迫耐受性的方法。
全文摘要
来自单子叶植物如水稻的基因的鉴定，该基因编码特异于胁迫耐受基因的转录因子，利用该基因提供新的环境胁迫耐受植物。从水稻基因组中，鉴定了一个结合于存在于编码胁迫反应蛋白质的基因的上游的顺式元件并且编码和激活基因转录的转录因子的基因。另外，将转录因子的基因用于转化植物，从而提高对环境胁迫如低温，脱水，和盐胁迫的耐受性。
文档编号C12N15/29GK1431309SQ0215428
公开日2003年7月23日 申请日期2002年11月22日 优先权日2001年11月22日
发明者筱崎和子, 伊藤裕介, 佐久间洋 申请人:独立行政法人国际农林水产业研究中心, 生物系特定产业技术研究推进机构