专利名称：鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种四号生理小种的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一对辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的引物及其应用。
背景技术：
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)具有生理小种分化现象，目前国际上常见的报道是将其划分为6个小种，目前国内外对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种生理小种鉴定大多数采用鉴别寄主法(Vicente，J. G. ,Conway, J.，Roberts，S. J.，and Taylor, J. D. 2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv.campestris races and related pathovars.Phytopathology 91 492-499.严红，裘季燕，张涛涛，田兆丰.2001.白菜苗期三种病原复合接种的多抗性鉴定方法研究.植物病理学报，31C3) :109-113.)。基于生理小种鉴定的常规鉴别寄主法存在鉴定时间长和受环境因素影响大等缺点，迫切需要注入现代分子技术手段。AFLP标记是扩增片段长度多态性技术(amplified fragment length polymorphism, AFLP)是由荷兰科学家 Zabeau 及 Vos(Zabeau Μ, Vos P. Selective restrietion fraglnent amPlifieation a general method for DNA fingapnnting[J]. European Pat Ent Applieation 942060297 (Pubulication No. 0534858). Paris =European Patent Offiee,1993. 1405.)在 1993年发展起来的一种新的检测DNA多态性的方法。AFLP标记技术的出现，是DNA指纹技术的重大突破。该技术最初用于植物的遗传育种、种质资源鉴定等，现已被大量用于动植物和微生物遗传多样性分析、遗传图谱的构建、医疗诊断、系统发育和分类等研究领域。AFLP 技术是目前使用的一种比较有效的基因多态性分析方法，它既包含了 RFLP分析的可靠性又具有PCR的能力，是一种相对价廉、简单、快速和可靠的DNA指纹技术，可产生几百条遗传标记。2001 年，Vicente 等人(Vicente, J. G. , Conway, J. , Roberts, S. J. , and Taylor, J.D.2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv. campestris races and related pathovars. Phytopathology 91 :492-499. ) 144 ^ ! , ^t Wirosa Fl (B. oleracea)、Just Right Hybrid Turnip (B. rapa)、Line 14R of Cobra (B. napus)、 Seven Top Turnip (B. rapa) > PI 199947 (B. carinata) > Florida Broad Leaf Mustard (B. juncea)和Miracle Fl (B. oleracea)等7个十字花科蔬菜品种(鉴别寄主)上进行了十字花科黑腐病菌致病性的测定，根据Xanthomonas campestris pv. campestris在这7个品种上的不同的致病情况，将收集到的菌株鉴定为6个生理小种，即小种1、2、3、4、5和6号，其中1号小种占62 %，4号小种占32 %，其余4个小种共占6 %。我国十字花科蔬菜黑腐病菌的致病力分化研究比较常见，但是目前未见该菌生理小种的相关报道。目前国内进行致病型划分常用的方法是鉴别寄主法。了解我国十字花科黑腐病菌的生理小种分布，对十字花科蔬菜的种植及抗病性育种等方面有指导作用。
发明内容
本发明的目的是提供一对辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris) 0 /]、禾中白勺弓L&gj^ffi。本发明所提供的辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的引物，名称为I3Xcl它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。本发明还提供一种辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的试剂盒，包括权利要求1所述的引物。本发明提供的上述引物的应用，是上述引物在辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种中的应用，该辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的方法，包括下述步骤1)待测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；2)鉴定步骤1)所述的PCR扩增产物的大小，扩增产物中含有一个230bp的DNA片段的待测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种。上述引物和所述试剂盒均可应用于筛选不同生理小种的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株，特别是筛选四号生理小种的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株。可以利用本发明的引物对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株进行生理小种鉴定缩短鉴定时间，从而较快地鉴定出野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种， 利用本发明引物进行鉴定生理小种的方法克服了传统生理小种鉴定方法鉴别寄主法中易受环境因素和鉴别寄主生长期长的干扰而导致鉴定效率低等问题。
图1为本发明鉴定四号生理小种引物扩增野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris) 一号至六号生理小种标准菌株的结果，图中， 泳道M为分子量Marker (D2000 DNA Ladder)，泳道1_6分别为野油菜黄单胞菌野油菜致病变禾中(Xanthomonas campestris pv. campestris) 一号至六号生理小禾中标准菌株，ck为是以清水为模板的PCR扩增。图2为本发明鉴定四号生理小种引物扩增野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的结果，最左侧泳道为分子量 Marker (D2000 DNA Ladder)，左侧第二泳道是以四号生理小种标准菌株为模板的扩增产物，其余是以鉴别寄主法鉴定的四号生理小种菌株为模板的扩增产物。图3为本发明鉴定四号生理小种引物扩增野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris)非四号生理小种的结果，最左侧泳道为分子量Marker (D2000 DNA Ladder)，左侧第二泳道是以四号生理小种标准菌株为模板的扩增产物，其余是以鉴别寄主法鉴定的非四号生理小种菌株为模板的扩增产物。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的引物及其应用一、鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的引物的获得采用AFLP标记(扩增片段长度多态性技术)方法对六个生理小种标准菌株进行分析，得到六个生理小种标准菌株的AFLP指纹图谱，将四号生理小种标准菌株具有的特异条带进行回收，得到四号生理小种特有的DNA片段，对此DNA片段进行测序，根据所得序列设计引物，所得引物即为本发明的引物hcMPrimer )(CC4的缩写)。引物序列为上游正向引物序列为5，-GAAGCTCCTCGCGGAAATG-3 (序列表中序列1)，下游反向引物序列为 5，-CAAGGCATATGCACTGAGCG-3 (序列表中序列 2)。二、本发明的鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的引物(Pxc4)的效果验证1、引物合成Pxc4引物对上游正向引物序列为5，-GAAGCTCCTCGCGGAAATG-3 (序列表中序列 1)，下游反向引物序列为5，-CAAGGCATATGCACTGAGCG-3 (序列表中序列2)，委托上海生工生物技术有限公司合成。2,Pxc4引物对的扩增与四号生理小种的相关性验证购自英国华威大学的 HRI 3811 Xcc race 1 (Xanthomonas campestris pv. campestrts 一号生理小禾中)，HRI 3849A Xcc race2(Xanthomonas campestrts pv. campestrts 二号生理小禾中)，HRI 5212 Xcc race3(Xanthomonas campestris pv. campestris 三号生理小禾中)，HRI 1279A Xcc race4(Xanthomonas campestris pv. campestris 四号生理小禾中)，HRI 3880 Xcc race5 (Xanthomonas campestris pv. campestris 五号生理小禾中)，HRI 6181 Xcc race6(Xanthomonas campestris pv. campestris六号生理小种)六个生理小种代表性菌株，和从我国不同地区采集分离到的44野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)菌株， 已经采用鉴别寄主法(Vicente, J. G.，Conway, J.，Roberts, S. J.，and Taylor, J. D. 2001. Identification and origin of Xanthomonas campestris pv.campestris races and related pathovars. Phytopathology 91:492-499.严红,裘季燕，张涛涛，田兆丰· 2001. 白菜苗期三种病原复合接种的多抗性鉴定方法研究.植物病理学报，31C3) :109-113.)鉴定出其生理小种类别，其中四号生理小种22株，其余22株中，4株是3号生理小种，18株1 号生理小种。采用 CTAB 法分别提取每个 Xanthomonas campestris pv. campestris 菌株的全基因组DNA，以上述)(CC4引物对进行PCR扩增实验。PCR 反应体系为10 X Ex Buffer 2. 5 μ 1 (含 Mg2+)，dNTPl μ 1 (IOmM)，上游正向引物和下游反向引物各 1 μ I(IOmM)，基因组 DNAl μ l(10ng/μ 1)，Ex Taq 酶 0. 2 μ 1 (5U/μ 1)， 反应体积为25 μ 1。PCR 反应程序为94 °C 3min ； 94°C 30s、58°C 30s, 72 °C 60s，35 个循环；72 °C 5min。PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。结果见图1-图3。结合PCR扩增实验结果，分析如下供试的六个生理小种标准菌株中，只有四号生理小种存在一个230bp的DNA 特异性扩增片段。全部的22个四号生理小种有14个能检测到该特异带型Q30bp)，检出率为63. 6%;而在22份其他生理小种材料中只有3份检测到该特异带型。因此，引物I^XC4 是与四号生理小种相关位点相连锁的标记，可以用于四号生理小种的辅助鉴定。
权利要求
1.一对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。
2.一种辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的试剂盒，包括权利要求1所述的引物。
3.权利要求1所述的引物在制备辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小禾中中的应用。
5.一种辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)四号生理小种的方法，包括下述步骤1)待测野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv. campestris) 的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；2)鉴定步骤1)所述的PCR扩增产物的大小，扩增产物中含有一个230bp的DNA特异性扩增片段的待测 Xanthomonas campestris pv. campestris 菌株为 Xanthomonas campestris pv. campestris 四号生理小禾中。
全文摘要
本发明公开了一对辅助鉴定野油菜黄单胞菌野油菜致病变种四号生理小种的引物及其应用。该对引物，它们的核苷酸序列分别为序列表中序列1和序列表中序列2。可以利用本发明的引物对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种菌株进行生理小种鉴定缩短鉴定时间，从而较快地鉴定出野油菜黄单胞菌野油菜致病变种四号生理小种，利用本发明引物进行鉴定生理小种的方法克服了传统生理小种鉴定方法鉴别寄主法中易受环境因素和鉴别寄主生长期长的干扰而导致鉴定效率低等问题。
文档编号C12R1/64GK102373199SQ20111035017
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者严红, 刘凡, 林秀敏, 燕继晔, 翟文慧 申请人:北京市农林科学院