一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学检验技术领域，具体而言，涉及一种高浓度微生物制剂产品 含菌量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 微生物制剂在农业中的应用主要为种植和养殖过程中，在种植上的主要作用表现 为促进植物生长、提高植物防病抗病能力、提高肥料利用率、提高植物抗旱、修复土壤、降解 农药等;在养殖上的主要作用表现为补充、调整或维持动物肠道内微生态平衡，促进机体肠 道吸收和提高宿主免疫水平;它还可以对由于集约化养殖造成的水体环境污染进行调整和 修护，保持养殖环境的生态平衡。
[0003] 由于制备方法的限制，传统的微生物制剂的浓度通常较低，如生物有机肥微生物 制剂的产品的浓度标准一般在〇. 2亿/g或0.2亿/mL左右。随着微生物制剂制备工艺的不断 完善，产品中的微生物浓度也不断攀升，制剂中微生物密度极大，从而使得稀释液中的微生 物不完全分散，如果用现有检测方法进行含菌量检测，培养基上的多个微生物可能会生长 成为一个菌落，由此导致菌落数的统计结果大大低于实际值，从而使微生物含量的检测结 果低于实际水平。
[0004] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述的检测 方法可解决现有技术在检测高浓度微生物制剂的含菌量时不准确的问题。
[0006] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0007] -种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，包括：
[0008] 1)、称量微生物制剂样品并加入溶剂中混匀，得第1稀释液；
[0009] 2)、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；
[0010] 3)、重复步骤2)n次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得到 第3、4、5……n+2稀释液；
[0011] 4)、取2~4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合 稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。
[0012] 本申请提供的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，通过将样品梯度稀释并 充分振荡分散以减小每一次稀释时带来的系统误差和偶然误差，从而更精确地进行检测。
[0013] 由于本方法用于微生物制剂产品的含菌量检测，而微生物制剂在进行工业生产时 的大致含菌量范围是可以根据生产流程进行推断的。因而本申请提供的方法多用于含菌量 的精确检测或对成品的质检。故而根据样品菌的大致含量选取2~4个连续稀释度足以将最 佳稀释度选定在内。
[0014] 优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤4)中，在取 2~4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数时具体包括：
[0015] 取2~4个连续稀释度的菌液及等量的所述溶剂均匀涂于培养基表面，每个稀释度 做2~4个重复，36~38°C培养1~3天，培养完成后统计菌落个数。
[0016] 取溶剂培养的目的是为了提供空白对照，防止因溶剂被微生物制品污染而造成计 数不准。
[0017]优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述检测方法的 适用微生物制剂的浓度范围为：
[0018] lCKZi/g~150(HZi/gSl(HZi/mL~150(HZi/mL。
[0019] 优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤1)中，称取 微生物制剂样品的量为lg或lmL;在步骤1)~3)中，所述稀释液的稀释倍数均为上一稀释液 或微生物制剂样品原样的8~15倍。
[0020] 限定稀释起点的目的是，虽然使用更少的样品如O.Olg或lyL会方便操作，但在测 量的是如此高浓度的微生物制剂的前提下，称量的量越少，误差越大；
[0021] 在8~15倍的稀释倍数下，样品可以被溶剂充分稀释，且误差也不会很大;若稀释 倍数过大，虽然可以减小误差，但稀释所用溶剂的量过大，难以操作。
[0022] 因而综合上述两点原因，本申请优选限定稀释起点为lg或lmL，且进行梯度稀释。
[0023] 在操作时，为了方便计算，在步骤1)中，称取微生物制剂样品的量为lg或lmL(称量 精确到千分位），溶剂的量为9mL;
[0024] 在步骤2)中，吸取第1稀释液的量为lmL，溶剂的量为9mL。
[0025] 此外，在本领域中，在固体微生物制剂产品计数稀释时，近似的认为lg加入9mL溶 剂即为稀释10倍。
[0026] 优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述溶剂为无菌 水。
[0027] 溶剂也可根据微生物种类进行其他选择，如以常见的缓冲液(PBS、TBS)进行稀释 等。
[0028] 优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述混匀为使用 摇床混匀;所述振荡为使用小型旋涡振荡器进行振荡。
[0029]进一步优选的：
[0030] 在步骤1)中，摇床的转速为150~300转/min，所述混匀的时间为20~40分钟；
[0031]在步骤2)中，振荡的频率为40~80Hz，所述振荡的时间为20~40秒。
[0032] 在步骤1)中，由于初始加入了样品中含菌量非常巨大，为了充分地分散以减小后 续份数造成的误差，因而摇床的转速比较快，且混匀时间较长。
[0033] 优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，在步骤3)中，n = 4 ~8〇
[0034] n = 4~8即最高稀释倍数为1:1 X 106~1:1 X 1010。
[0035]优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述微生物制剂 产品中的微生物为光合细菌、放线菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫化细菌、酵母菌、蛭弧菌、乳 酸菌或芽孢杆菌中的一种。
[0036]本申请适用于单一菌种制成的微生物制剂；
[0037]若想将本申请应用于复合微生物制剂，则需要针对该复合微生物制剂中的微生物 类型选配不同类型的培养基。
[0038]优选的，如上所述的高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，所述微生物制剂 产品为经喷雾干燥制成枯草芽孢杆菌制剂。
[0039] 经喷雾干燥制成芽孢杆菌制剂为申请人(北京世纪阿姆斯生物技术有限公司）所 生产的产品，其菌含量很高，芽孢杆菌浓度可达1〇〇〇亿/g以上。
[0040] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0041] 1)、经过特定时间的振荡后，高浓度微生物制剂产品可被高度均一地分散在溶剂 里，大大减小了梯度稀释时造成的误差，测量更准确。
[0042] 2)、以8~15倍为间隔进行梯度稀释，误差比直接稀释到更高倍数要小的多，更适 合10亿/g~1500亿/g或10亿/mL~1500亿/mL的微生物制剂样品的检测，对评定高浓度微生 物制剂质量、指导生产具有重要意义。
[0043] 3)、本申请提供的检测方法操作简单，易于掌握。
【具体实施方式】
[0044]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0045] 实施例1
[0046] -种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，包括：
[0047] S11、称量微生物制剂样品并加入溶剂中混匀，得第1稀释液；
[0048] S12、吸取所述第1稀释液加入溶剂中，振荡，得到第2稀释液；
[0049] S13、重复步骤S12八次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得 到第3、4、5……10稀释液；
[0050] S14、取4个连续稀释度的菌液均匀涂于培养基表面培养并统计菌落个数，结合稀 释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度微生物制剂产品含菌量。
[0051 ] 实施例2
[0052] 一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法，以1500亿/mL的芽孢杆菌制剂检 测为例，包括：
[0053] S21、称量l.OOOmL芽孢杆菌制剂样品并加入9mL溶剂中，与摇床上300转/min孵育 40分钟，得第1稀释液；
[0054] S22、吸取所述第1稀释液lmL加入9mL溶剂中，使用小型旋涡振荡器，80Hz振荡40 秒，得到第2稀释液；
[0055] S23、重复步骤S22八次，每次均从上一次得到的稀释液中吸取并进行稀释，分别得 到第3~10稀释液；
[0056] S24、取第7、8、9、10稀释液的菌液及等量的所述溶剂均匀涂于培养基表面培养并 统计菌落个数，结合稀释倍数及涂板时吸取的稀释液体积逆推得到高浓度芽孢