cTnⅠ主要表位区的重组表达及其抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，涉及人肌钙蛋白I(CTnI)的三个主要表位区的重组表达及其相应抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]急性心肌梗塞(AMI)是临床常见急性多发病，是威胁人类生命的主要疾病之一。在AMI生化诊断指标方面，肌酸激酶同工酶(CK-MB)—度被认为是诊断的“金标准”，但CK-MB非心脏特有，非心脏手术或骨骼肌损伤病人也常出现CK-MB增高，造成AMI诊断假阳性。近年来的研究表明，人心肌肌I丐蛋白I(cardiac troponinl，cTnl)具有高度心肌特异性，当心肌细胞受损时，血液中的cTnl出现时间早，持续时间长，与心肌损伤程度及预后密切相关，可作为心肌损伤诊断的一项特异性指标，正逐步取代CK-MB成为判断心肌损伤的新的特异性标准物。
[0003]肌钙蛋白(Troponin，Tn)由肌钙蛋白I(TnI)、肌钙蛋白C(TnC)和肌钙蛋白T(TnT)三个亚单位组成。TnI有三种亚型:快型骨骼肌亚型，慢型骨骼肌亚型和心肌亚型。心肌肌钙蛋白I(cTnl)在心肌组织中表达，在骨骼肌中不表达，具有心肌的高度特异性。正常情况下cTnl与TnT和TnC结合，以三元复合物的形式存在，AMI后cTnl释放入血，其在血清中大部分以复合物的形式存在，其中4.1%为游离型，还可能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解片段等多种形式存在。
[0004]cTnl共有210个氨基酸，含2个半胱氨酸，原核表达系统中表达的重组蛋白均为包涵体，较难复性，且复性后的蛋白易被蛋白酶降解，难以保存。目前cTnl蛋白主要从人心肌组织提取，来源有限，成本昂贵，很难大量制备，所以表达高免疫原性的人cTnl蛋白，并制备其特异性抗体具有很好的市场前景。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种cTnl主要表位区的重组表达方法。根据cTnl表位图谱和蛋白结构，本发明选取了位于cTnl的N端、C端和中间稳定区的三个表位区，在大肠杆菌表达系统中均获得可溶性表达。本发明还公开了使用三种重组蛋白制备cTnl单克隆抗体、多抗血清的方法。
【附图说明】
[0006]
图1是本发明制备人CTnI主要表位区重组蛋白的流程示意图；
图2是本发明制备重组cTnI主要表位区的SDS-PAGE电泳图:
1、Ni2+螯合亲和柱纯化cTnl-N融合蛋白；
2、Ni2+螯合亲和柱纯化cTnl-S融合蛋白；
3、附2+螯合亲和柱纯化(^111-(:融合蛋白； 4、酶切纯化后cTnl-N蛋白；
5、酶切纯化后cTnl-S蛋白；
6、酶切纯化后cTnl-C蛋白；
7、TF蛋白;
图3是使用本发明的方法获得的重组cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C蛋白免疫原性的检测；
图4是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C偶联载体蛋白后，免疫兔子，对所制备的多抗血清进行效价检测；
图5是使用本发明的方法获得的重组蛋白cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C免疫小鼠，对所制备单抗腹水进行效价检测。
【具体实施方式】
[0007]实施例l:cTnI_N编码序列的扩增
cTnl-N包含了全长cTnIN端的特征性表位区。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl编码序列所构建的重组质粒)扩增出cTnIN端1-79位氨基酸的编码序列，所用的引物N5的5 ’端添加了NdeI的酶切位点，引物N3的3 ’端添加了XbaI的酶切位点cTnN5:5’-aagcatatggccgatggttcttccgatg-3’cTnN3: 5’-aagtctagagcaacgcgtgctcagtgc-3 ’
100 μ?的PCR反应体系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20ymol/L的cTnN5和cTnN3各2yl，2.5mmol/L的dNTP加入8yl，10XPCR反应缓冲液加入10yl，PCR的反应条件为:94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55 V退火30秒，72°C延伸50秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离出PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
[0008]实施例2: cTnl-S编码序列的扩增
cTnl-S是指cTnl序列中部的稳定区。使用PCR方法从质粒PUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl编码序列所构建质粒)扩增出cTnl稳定区28-110位氨基酸的编码序列，所用的引物cTnS5的5 ’端添加了NdeI的酶切位点，引物cTnS3的3 ’端添加了XbaI的酶切位点cTnS5:5’-aagcatatggcgtatgccaccgaaccg-3’cTnS3: 5’-aagtctagattcttcgtcaactttatccacgcg-3’
100 μ?的PCR反应体系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20ymol/L的cTnS5和cTnS3各2yl，2.5mmol/L的dNTP加入8yl，10XPCR反应缓冲液加入10yl，PCR的反应条件为:94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，55 V退火30秒，72°C延伸50秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
[0009]实施例3:cTnI_C编码序列的扩增
cTnl-C包含了全长cTnIC端区域的序列。使用PCR方法从质粒pUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl编码序列所构建质粒)扩增出cTnIC端150-210位氨基酸的编码序列，所用的引物C5的5 ’端添加了NdeI的酶切位点，引物N3的3 ’端添加了XbaI的酶切位点cTnC5:5’-aagcatatggcggatgccatgatgcag-3’cTnC3: 5’-aagtctagacgattcaaatttctttttacgacc-3 ’ 100 μ?的PCR反应体系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20 ymol/L的cTnC5和cTnC3各2 μ1，2.5 mmol/L的dNTP加入8 μ?，10 XPCR反应缓冲液加入10 μ?，PCR的反应条件为:94 °C预变性5分钟，94 0C变性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下、纯化。
[0010]实施例4:重组cTn1-N、cTn1-S和CTn1-C融合蛋白表达载体的构建
分别取3 yg cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C编码序列的PCR回收产物，分别建立50μ1的双酶切体系，具体如下:3yg的PCR回收产物，5μ1 1X !'酶切反应缓冲液，1.5μ1 NdeI和1.5μ1XbaI，加双蒸水至总体积50μ1，37°C水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒(OMEGA B1-TEK)进行回收。
[0011]取600ng的pCold? Ti7DNA(Takara)，建立50 μ?的双酶切体系，具体如下:600ng的?(:01(^巧?0嫩质粒，541的10\1'酶切反应缓冲液，1.SylNdeMPl.5μ1 XbaI，加双蒸水至总体积50μ1，37°C水浴中反应6小时，核酸凝胶电泳，切胶，使用凝胶回收试剂盒(OMEGA B1-TEK)纯化pCold?TF DNA质粒的双酶切产物。
[0012]连接反应:取4 口1经过纯化的？(:01(^巧？ DNA的NdeI和XbaI双酶切产物，