专利名称：一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种模拟猪生长激素样的活性肽，即一种利用噬菌体表面展示技术筛选的，能模拟猪生长激素的多肽，还涉及一种模拟猪生长激素样作用的活性肽及制备方法与应用。
背景技术：
猪生长激素由猪垂体分泌，是一种能促进机体生长，调节代谢的蛋白多肽激素。大量研究证明，猪生长激素能显著提高猪生长速度、瘦肉率和饲料报酬，对猪的生产、育种和饲料的调制产生重大的影响。但是因为担心激素残留问题，外源性生长激素被禁止在动物上使用，因此深入研究生长激素其促生长的机理并寻找安全有效的替代物一直是动物营养学重要的研究方向。
近年来，很多研究利用噬菌体展示肽库技术筛选抗配体技术，在寻找模拟激素的生物活性肽的研究中日益受到重视。噬菌体展示技术是Smith于1985年开创的一种基因表达和亲和选择相结合的技术，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽淘选出来。该技术是近年来新兴的研究配体与受体相互作用位点的强有力的工具。MOTTI针对抗乙肝表面抗原单抗应用随机肽库筛选获得的小肽进行测序，找到了与天然抗原的序列非常相近的氨基酸序列，结果证实筛选的得到的其中一个氨基酸序列与天然抗原氨基酸序列极相似。 Wrighton等利用噬菌体位随机肽库中筛选能够模拟EPO分子的活性的环肽，通过受体二聚化的诱导，引起信号传导一系列作用，来促进生长与分化，刺激体内网织红细胞数目的增加，除此之外，TPO模拟肽，药物配体肽等，都有相应的报道。发明内容
本发明提供一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用，目的在于克服为了促进动物生长而使用外源生长激素带来残留的不足。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
本发明所述模拟猪生长激素样的活性肽的氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD。
—种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用，包括如下步骤(1)以1A3为噬菌体筛选靶标，采用噬菌体随机12肽库进行了四轮淘洗，经噬菌体克隆、回收、富集、扩增后，经间接ELISA检测，发现有若干个噬菌斑阳性克隆与1A3存在特异性结合，将特异性结合的阳性克隆提取ssDNA，进行序列测定及比对分析，即得所述多肽的氨基酸序列。
(2)以筛选到的多肽为基础，对比核心氨基酸序列，以核心氨基酸序列为基础通过计算机软件设计合成多肽，，然后与猪肝细胞膜上生长激素受体进行特异性结合试验，包括竞争性结合，BIAcore分析，受体二聚化分析，信号转导分析，计算机生物学分析等检验筛选出具有生长激素受体结合的多肽，然后证明其生长激素样作用。
本发明利用噬菌体表面展示技术筛选过程如下选择已获得国家发明专利200510016662. 9的单克隆抗体作为筛选靶标，以下简称1A3 ；之所以选择1A3是因为在以往的试验中我们证实1A3上与生长激素结合的位点和生长激素与受体的结合位点相同，以 1A3单克隆抗体包被聚苯乙烯板上(注，加入噬菌体随机12-肽库(NEB公司商品化肽库)， 主要按噬菌体展示肽库说明书操作，筛选过程简要介绍为首先从12-肽噬菌体文库中筛选与1A3特异性结合力的噬菌体，洗涤以去除非特异性结合的噬菌体，后用洗脱液将结合在1A3单克隆抗体的噬菌体洗脱下来，感染大肠杆菌ER2738，扩增后将噬菌体提取纯化，即为第一轮的富集噬菌体，然后进行第二轮与第三轮筛选，过程与第一轮方法一致，只是不断加强洗脱强度，第三轮，四轮筛选方法与前两轮方法一致，经过四轮轮筛选后，得到与生长激素单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽，再将第三轮筛选的噬菌体单克隆化，并结合ELISA、竞争ELISA挑选出与1A3单克隆抗体有强阳性反应的噬菌体克隆，然后进行鉴定，证明与噬菌体结合位点是噬菌体的P III蛋白质所携带外源多肽。
所述的模拟猪生长激素的活性肽在制备猪促生产制剂中的应用，可应用于生长阶段的猪，通过促进机体合成代谢和脂肪分解，促使蛋白质合成。达到促进猪的生长，提高生长速度的目的。
本发明以生长激素结合蛋白为筛选靶标，通过一系列随机肽库的筛选结合相关的生物技术找到能够模拟生长激素特性的生物活性肽是解决问题的关键。生物活性肽，不是生物激素，只是一种能够模拟激素生物活性的多肽，以模拟生长激素的作用等方式来调节内分泌系统的激素水平，以期达到提高生长速度，改善胴体品质的目的。发挥促进动物生长作用，克服了激素残留的问题，因此对动物的健康绿色养殖具有重大的经济价值和现意义。
本发明具有如下优点和积极效果1、本发明通过利用噬菌体表面展示技术筛选出能模拟猪生长激素的活性肽，得到了氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD的肽，简称为GHMP，该活性肽能够与猪肝脏细胞膜上生长激素受体结合。
2、本发明筛选所得的生物活性肽能部分模拟猪生长激素的小肽，是模拟部分生长激素功能的噬菌体多肽易生产、易分离，因而价廉，可以安全使用。
目前，激素的滥用已成为世界性的问题，尤其是饲料中人为添加激素物质，给人类食品安全带来了重大隐患，因而，探讨能够制备出能够模拟动物生长激素作用物质，并减少由于激素带来的动物产品激素残留的隐患，就显得尤为重要。而用本发明所采用的方法筛选到的模拟肽有很多优点1.与天然激素相比，小肽氨基酸数量少，易合成，成本低；2.安全性高，制备方法简单，可以大量合成，满足不同的需要；3.可根据计算机软件进行进一步进行改造以满足不同的需求；4.纯蛋白类制剂，在体内代谢降解快，无毒副作用；5.提供了一种建立相应激素模拟物的制备方法和范例。
图1表示正常分离的肝脏细胞；图2表示TRITC-GHMP结合到肝脏细胞膜上； 图3 =DAPI染色细胞核； 图4 =FITC-GH染色受体； 图5 TRITC-GHMAS结合细胞图片；图6是图3、图4和图5合成图片； 图7为阴性对照图； 图8为竞争性结果图；图9模拟肽和生长激素启动JAK2磷酸化水平对照分析图；图10 -Γ图10-6是STAT5磷酸化程度与GHMP的作用的时间和剂量单荧光强度峰图； 其中每个直方图的横坐标表示STAT5磷酸化程度(平均荧光密度)，纵坐标表示细胞数量，图 10-1表示阴性对照(作用20min时，没有给予GHMP的刺激而只是给予不相关肽的刺激，因此没有启动信号转导)；图10-2至图10-6表示作用20min时，随着GHMP剂量的增加(5ng ； IOng ；20ng ；50ng ；80ng), STAT5 磷酸化平均荧光强度逐渐增强(22. 60 ；38. 01，；68. 37 ； 133. 80 ； 168. 82)，说明信号转导能力增强。
具体实施方式
一、本实施例所用的主要实验材料和试剂及其来源(一)实验材料1、噬菌体随机12-肽随机肽库，购自NEB公司，生长激素结合蛋白购自 sigma公司ο
2、生长激素受体抗体购自sigma公司3、兔抗M13血清购自sigma公司；4、羊抗兔酶标抗体(Goat anti-Rabbit HRP)、羊抗鼠酶标抗体(Goat anti-Mouse HRP)购自博奥森公司；5、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺 (DAB)、酶标板均购自美国sigma公司；6UA3单克隆抗体由本实验室制备保存；7、JAK2试剂盒购自BD公司；8、STAT磷酸化抗体购自CST公司；9、TRITC与 FITC 购自 sigma 公司；10、肽合成在华大基因公司；11、生长激素受体抗体购自abeam公司；12、羊抗鼠与羊抗兔FITC标记二抗购自sigma公司。
( 二)主要试剂1、培养基配制(主要过程按照肽库说明书)1. 1 LB ^1^ IOgBacto-Tryptone, 5g yeast extract, 5gNaCl。高fli灭菌，室温贮存。
1.2 LB/IPTG/Xgal平板LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C 时，加入lmllPTG/Xgal，勻倒平板。平板4°C避光贮存。
1.3 顶层琼月旨每升含10g Bacto-Tryptone,5 g yeast extract, 5 g NaC 1, IgMgCl2 · 6H20, 7g琼脂粉高压灭菌，分成50ml等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
1. 4 四环素贮液以20mg/ml的浓度溶于乙醇中，_20°C避光贮存。用前摇勻， LB-Tet平板LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时，加入Iml四素贮液，混勻倒平板。平板4°C避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。封阻缓冲液 0. IMNaHCO3 (pH8. 6)，5mg/mlBSA, 0. 02%NaN3。过滤除菌，4°CC存。
1. 5 TBS:50mMTris-HCl (ρΗ7· 5)，150mM NaCl。高压灭菌，室温C存。PEG/NaCl 20% (w/v) PEG-8000，2. 5M NaCl。高压灭菌，室温C存。
1.6 碘化物缓冲液将1.5mg链霉亲和素冻干粉(本试剂盒提供)溶于Iml IOmM 磷酸钠(pH7. 2)、100 mM NaCUO. 02% NaN3溶液中。4°C或_20°C贮存，避免反复冻融。
1. 7 IPTG/Xgal 配方将 1. 25gIPTG (isopropyl - D-thiogalactoside)和 Ig Xgal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-^ -D-galactoside)溶于 25ml 二甲基甲酰胺中。溶液-20°C避光贮存。
二、噬菌体淘选程序1.配制好lOOPg/ml的生长激素结合蛋白分子溶液(溶于0.1M pH 8.6 WNaHCO3);2.每孔板中加入150μ 上述溶液；3.在增湿容器中4°C轻微震荡，孵育过夜。平板可在此容器中4°C贮存备用；4.挑ER2738单克隆(噬菌体滴度测定时铺的板)于10ml LB液体培养基中。如果同一天扩增洗脱的噬菌体，也可将ER2738接种于20mlLB液体培养基，这时请用250ml三角瓶(不要用50ml锥形管)，37°C剧烈震荡培养；5.倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每板(或孔)加满封阻液，4°C作用至少Ihour ；6.按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0. 1% [v/v] Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液；7.用Iml(微孔板则用100 μ )的TBST缓冲液稀释2 X IO11的噬菌体(即10μ1的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动30min。
8.倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液； 9.按6中所述方法用TBST缓冲液洗板10次，每次洗版换一干净纸巾；10 加入0.2 M Glycine-HCl (pH 2. 2)，lmg/mlBSA温和摇动 >10 min，洗脱液吸入另一干净微量离心管中。然后再用150 μ (微量孔则用15μ1) IM Tris-HCl (ρΗ9· 1)中和上述洗脱液；11.按上述常规Μ13方法中的程序测定少量洗脱物的滴度；12.对剩余洗脱物应进行适当扩增将洗脱物加入到20mlER2738培养物中37°C剧烈摇动培养4. 5小时；13.将培养物转入一离心管中，然后，4°C10，OOOrpm离心lOmin。上清液转入另一离心管中，再离心；14.将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4°C沉淀至少60min，过夜；15.过夜后，4°C10，000 rpm离心PEG沉淀15min，倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；16.沉淀物重悬于ImlTBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀；17.上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育 15-60min。4°C离心lOmin，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清；18.沉淀物重悬于200μ1TBS, 0. 02%NaN3中，离心lmin，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物；
19.根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物，4°C贮存；
20.再包被一个96孔板准备第二轮淘选时用；
21.计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于2X1011pfu的加入量，如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至IO9 pfu的噬菌体加入量进行试验；
22.进行第二轮淘选用第一轮淘选扩增的洗脱物中ZXlO11Pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增0. 5% (ν/ν)；
23.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后滴度；
24.再包被一个板或孔准备第三轮淘选时用，方法见1-3;
25.进行第三轮淘选用第二轮淘选扩增的洗脱物中ZXlO11Pfu的噬菌体量重复步骤 4-11，清洗步骤中同样用0. 5%(ν/ν)的Tween ；
26.在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度；
27.在此基础上进行第四轮扩增，方法同上；
28.按照试剂盒说明书进行噬菌体克隆提取与测序。
三、肽序列的分析1. 1经过序列分析比对，得到了氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD的肽，并以此为基础合成多肽；1. 2合成肽的ELISA分析，以生长激素结合蛋白包被聚乙烯板，按照ELISA常规步骤测定合成肽(Growth Hormone Mimic Peptide简称为GHMP)与1A3单克隆抗体结合情况，合成肽的抗血清由实验室按照标准方法制备；1. 3BIAcore进一步分析肽与生长激素结合蛋白结合情况，以1A3单克隆抗体固定在 BIAcore芯片上，然后配置不同肽序列溶液，并按照操作手册进行结合测定；1. 4按照标准方法标记生长激素和生长激素结合肽，生长激素用FITC标记，生长激素模拟肽用TRITC标记，采用流式细胞仪与共聚焦显微镜观察分别进行不同浓度的竞争性试验，进行竞争性结合肝细胞膜受体的试验；1.5肽与肝细胞表面受体结合与分离常数的测定，按照标准方法进行操作； 1.6肽启动信号转导路径的的证明，新分离的肝脏细胞经不同浓度与不同时间的刺激后，对细胞进行固定，然后加入商品化抗磷酸化信号转导因子抗体，加入荧光标记的二抗， 然后进行流式分析；1. 7最终合成的模拟肽氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD。
下面结合试验例对本发明模拟肽作进一步说明。
试验例1 本发明模拟肽结合到新分离的肝脏细胞膜上本发明模拟肽，以下简称(GHMP)，通过ELISA，BIAc0re筛选能够与1A3单克隆抗体结合的肽。模拟肽起到生物学作用的重要一步是与细胞表面的受体相结合，因此我们采用ELISA 与BIAcore分析合成模拟肽序列及生长激素胞外域结合情况，ELISA按照标准过程操作， BIAcore分析是将1A3单克隆抗体固定在BIAcore芯片上，然后配置不同肽序列溶液，并按照操作手册进行结合情况测定，根据实验结果选择氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD的肽。
在新分离仔猪肝细胞模型上TRITC-GHMP结合到结合肝细胞膜上，并产生内化现象，参见图1和图2。
在新分离的肝脏细胞上，FITC-PGH与TRITC-GHMP共同结合与细胞表面受体。参见图3、图4、图5和图6。
TRITC-GHMP与FITC-GH的竞争性结果图。实验以过饱和的TRITC-GHMP与新分离肝脏细胞共孵育，然后以FITC-GH竞争性结合细胞膜表面受体，结果表明TRITC-GHMP能够抑制生长FITC-GH结合到细胞表面受体。参见图7、图8。
试验例2 模拟肽GHMP能够磷酸化JAK2在冰箱取出在BD公司购买的猪磷酸化JAK2 ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书操作，测定模拟肽激活JAK2磷酸化的能力。磷酸化JAK2是生长激素发挥生理作用中非常重要的一部分，下图是用磷酸化JAK2试剂盒测定GHMP能够起到生长激素样作用，激活JAK2，GHMP在磷酸化JAK2的程度与生长激素表现出一定的剂量依赖性，但启动的磷酸化水平要低一些。 参见图9。
试验例3 模拟肽GHMP激活细胞转录因子STAT5生长激素作用的经典模式是启动信号转导级联反应JAK2-STATS途径，我们通过不同的GHMP浓度给予其靶细胞，即对肝脏细胞进行不同浓度，不同时间，细胞刺激后进行固定， 并用权威文献报道的特异性的STAT家族磷酸化抗体进行染色，然后通过流式细胞仪分析， 判断启动信号转导情况，下图表明STAT5磷酸化程度与GHMP的作用的时间和剂量呈现一定的依赖性。图10每个直方图的横坐标表示，STAT5磷酸化强度，纵坐标表示细胞数量，从实验结果看磷酸化强度随着GHMP剂量增加而增强。通过统计学分析，差异显著，具有统计学眉、ο
权利要求
1.一种模拟猪生长激素样的活性肽，其特征在于其氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD。
2.如权利要求1所述的一种模拟猪生长激素样的活性肽的制备方法，其特征在于包括下列步骤(1)以1A3为噬菌体筛选靶标，采用噬菌体随机12肽库进行了四轮淘洗，经噬菌体克隆、回收、富集、扩增后，经间接ELISA检测，发现有若干个噬菌斑阳性克隆与1A3存在特异性结合，将特异性结合的阳性克隆提取ssDNA，进行序列测定及比对分析，即得所述多肽的氨基酸序列；(2)以筛选到的多肽为基础，对比核心氨基酸序列，以核心氨基酸序列为基础通过计算机软件设计合成多肽，，然后与猪肝细胞膜上生长激素受体进行特异性结合试验，包括竞争性结合，BIAcore分析，受体二聚化分析，信号转导分析，计算机生物学分析等检验筛选出具有生长激素受体结合的多肽，然后证明其生长激素样作用。
3.如权利要求1所述的一种模拟猪生长激素样的活性肽在制备猪促生产制剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种模拟猪生长激素样的活性肽及制备方法与应用，属于生物技术领域。其氨基酸序列为RPCLPHCNSTSD，可应用于生长阶段的猪，通过促进机体合成代谢和脂肪分解，促使蛋白质合成。达到促进猪的生长，提高生长速度的目的。小肽氨基酸数量少，易合成，成本低；安全性高，制备方法简单，可以大量合成，满足不同的需要；纯蛋白类制剂，在体内代谢降解快，无毒副作用。
文档编号C07K7/08GK102516364SQ201110442548
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者兰海楠, 刘景圣, 李维, 郑鑫 申请人:吉林农业大学