专利名称：一种四倍体萝卜的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种萝卜的育种方法，尤其是一种四倍体红心红皮萝卜的育种方法， 属于植物育种技术领域。
背景技术：
“红心萝卜又名胭脂萝卜，以皮肉全红、质地脆嫩而闻名，在贵州、四川及重庆等地广泛栽培”(见科学技术文献出版社出版的《中国萝卜》，P172页)。红皮红心萝卜系十字花科萝卜属萝卜种下的一个地方品种。主产重庆市涪陵区，临近县市及四川、贵州等省也有栽培。其肉质根皮根肉均为红色，色素含量丰富，其可食部分质地紧密、粗糙、不宜生食但可用于腌制泡菜。近年来，多用红皮红心萝卜提取萝卜红色素。萝卜红色素是一种天然食用色素，安全、无毒、无任何负作用、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用(Annamaryju等人,Photochmistry, 1997, 45:671-674)，是国家添加剂标准委员会允许使用的天然色素之一。在食品、化妆、医药领域有着巨大的应用潜力。萝卜红色素的开发利用，红色素含量和产量高的品种是基础。以前，红皮红心萝卜一直是由农民自繁自种，导致种子混杂、退化严重，萝卜红色素含量减少。 经过科研人员的不懈努力，通过收集、整理传统资源，现已繁育出不少红色素含量较高的品种，其红色素含量在12%左右。除传统繁育方法之外，还有通过化学处理获得多倍体植物的方法，所获得的多倍体植物在产量和营养品质上较同源二倍体品种有明显优势，如张红亮等人(南京农业大学学报，2008，31 (3) :47-50)采用秋水仙碱诱导获得了普通四倍体萝卜， 发现其产量和营养品质各指标如维生素、可溶性糖、有机酸、可溶性糖、还原糖，均较同源二倍体品种有明显优势，其植株形态特征均比二倍体高，且差异显著。虽然多倍体植物体内化学成分含量比同源二倍体含量高很多，但是多倍体往往结实率低或完全不育，红色素含量的高低更是未知。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有红皮红心萝卜产量和红色素含量较低的缺陷，提出一种四倍体红心红皮萝卜的育种方法，提高红心红皮萝卜的产量和红色素含量。本发明通过以下技术方案解决技术问题，一种四倍体红心红皮萝卜的育种方法， 包括以下步骤
步骤一、选取健康饱满的红心红皮萝卜种子，表面消毒30-60秒后，用氯化汞溶液浸泡处理12-15分钟，再用无菌水冲洗干净，一般冲洗3-5遍；
步骤二、将无菌的红心红皮萝卜种子接种至MS发芽培养基，在25±3°C、14±2 McT1的条件下培养3-5天，得到无菌红心红皮萝卜苗；
步骤三、将含子叶生长点的无菌红心红皮萝卜苗切取接种至MS液体诱导培养基中，在 14±2h*d 1光照下振荡诱导培养12 72小时；
步骤四、将诱导培养过的无菌红心红皮萝卜苗接种至固体分化培养基中，在25±3°C、光照时间为14±2 Md'光照强度为2000±10001ux的条件下培养，直至分化，生成再生芽；
步骤五、切取再生芽接种至生根培养基，经炼苗后移栽至田间，得到再生植株，即四倍体红心红皮萝卜植株。所用的红心红皮萝卜种子选取纯合二倍体红心红皮萝卜种子。 所述MS发芽培养基是由MS培养基1L、蔗糖20g 30g和8g 9g琼脂组成，pH为 5. 8 6. O。所述MS液体诱导培养基由MS培养基1L、0. I O. 2 mg NAA、5· Omg 6. Omg6-BA>5Omg 200 mg秋水仙喊组成，pH5. 8 6. O。所述固体分化培养基由MS培养基1L、0. Img O. 2 mg NAA、5· O mg 6· O 6-ΒΑ、20 g 30g鹿糖、8 9g琼脂组成，pH5. 8 6· O。所述生根培养基由MS培养基1L、0. 2 O. 3 mg NAA、20 g 30g蔗糖、8 9 g琼脂组成，PH5. 8 6. O。以上所有培养基中所含的MS培养基，以IL计，组成为=NH4HO3 1650mg, KNO31900mg, CaCl2*2H20 440mg, KH2PO4 170mg, MgSO4*7H20 370mg, FeS04*7H20 27. 8mg, Na2EDTA37. 3mg，H3BO3 6. 2mg，MnSO4eH2O 16. 9mg，ZnS04*7H20 8. 6mg，Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuSO4*5H20 0. 025mg,CoCl2*6H20 0. 025mg,KI 0. 83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸 0. 5mg，维生素BI 0. lmg,维生素B6 0. 5mg和余量的无菌水。按上述方法培育所得的四倍体红心红皮萝卜与其同源二倍体相比在植株生长的各个阶段均出现了变异。四倍体的茎、叶等营养器官和花器官、肉质根等生殖器官以及叶片下表皮气孔、保卫细胞叶绿体、花粉粒等细胞观察方面都表现出多倍体的巨大性，叶片厚度增加37% 46%。平均单个肉质根重增加13%左右，萝卜红色素含量比同源二倍体增加超过10%，花粉粒大小及气孔大小增加30%以上，差异极显著。其有益效果是提高了红心红皮萝卜的产量的同时提高红心红皮萝卜的红色素含量，具有广阔的市场前景。
具体实施例方式实施例一
本实施按以下方法培育四倍体红心红皮萝卜
(I)配制各种培养基包括不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培养基中所含的重量为
MS 培养基，以 IL 计，组成为=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2·2Η20 440mg, KH2PO4170mg, MgSO4·7Η20 370mg, FeSO4·7Η20 27. 8mg, Na2EDTA 37. 3mg, H3BO3 6. 2mg, MnS04.H2016. 9mg，ZnS04*7H20 8. 6mg，Na2MoO4*2H20 0. 25mg，CuS04*5H20 0. 025mg，CoC12*6H200. 025mg，KI 0. 83mg，肌醇 lOOmg，甘氨酸 2mg，烟酸 0. 5mg，维生素 BI 0. lmg，维生素 B60. 5mg和余量的无菌水，高温高压灭菌。发芽培养基为MS培养基IL+蔗糖20g+琼脂8 g，pH5. 8，高温高压灭菌。MS液体诱导培养基为MS培养基1L+0. Img NAA +5. Omg 6-BA+50mg秋水仙碱，pH5. 8，闻温闻压灭囷。固体分化培养基为MS培养基lL+0.05mg NAA+5. Omg 6-BA+20 g蔗糖+8 g琼脂，pH5. 8，闻温闻压灭囷。生根培养基为MS培养基1L+0. 2 mg NAA+20 g蔗糖+8 g琼脂，pH5. 8，高温高压灭菌。(2)按以下步骤培育四倍体红心红皮萝卜
步骤一、挑选饱满健康的纯合二倍体红皮红心萝卜种子(种子取自镇江农科所)，在超净工作台上用70%乙醇表面消毒30s ;用1%升汞(氯化汞)溶液处理12min，无菌水冲洗3次；
步骤二、将无菌的红皮红心萝卜种子接种到MS发芽培养基上，置于25°C、14 McT1培养5天，养成无菌苗；
步骤三、切取生长5天的无菌苗放入到含秋水仙碱的MS液体诱导培养基中，14 McT1光照下振荡培养72 h ；
步骤四、将步骤三中秋水仙碱处理过的无菌苗用无菌水清洗2次，切割后接入到不含秋水仙碱的固体分化培养基中，在室温25°C、光照时间为14 h.cT1、光照强度为2 000 Iux条件下培养，直至分化，生成再生芽；
步骤五、切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，再每天14小时光照、25°C下进行生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗3天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，800倍75%百菌清浸泡基部2分钟；把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养10天后移栽，得到再生植株；
(3)对照实验
对照组的实验步骤及用品与实验组相同，区别在于步骤三中的MS液体培养基中不含秋水仙碱，得到再生植株(对照)。取实验组和对照组再生植株的嫩叶，用流式细胞仪检测各植株倍性，确定发生变异植株的倍性水平。结果见表1，
表1 二倍体、四倍体萝卜比较
权利要求
1.一种四倍体红心红皮萝卜的育种方法，包括以下步骤步骤一、选取健康饱满的红心红皮萝卜种子，表面消毒后，用氯化汞溶液浸泡处理12-15分钟，再用无菌水冲洗干净； 步骤二、将无菌的红心红皮萝卜种子接种至MS发芽培养基，在25±3°C、14±2 McT1的条件下培养3-5天，得到无菌红心红皮萝卜苗； 步骤三、将无菌红心红皮萝卜苗切取接种至MS液体诱导培养基中，在MiZbcT1光照下振荡诱导培养12 72小时； 步骤四、将诱导培养过的无菌红心红皮萝卜苗接种至固体分化培养基中，在25±3°C、光照时间为14±2 Md'光照强度为2000±10001ux的条件下培养，直至分化，生成再生芽； 步骤五、切取再生芽接种至生根培养基，经炼苗后移栽至田间，得到再生植株，即四倍体红心红皮萝卜植株。
2.根据权利要求I所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述红心红皮萝卜种子选取纯合二倍体红心红皮萝卜种子。
3.根据权利要求2所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述MS发芽培养基是由MS培养基1L、蔗糖20g 30g和8g 9g琼脂组成，pH为5. 8 6. O。
4.根据权利要求2所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述MS液体诱导培养基由 MS 培养基 1L、0. I 0. 2 mg NAA、5. Omg 6. Omg 6-BA>5Omg 200 mg 秋水仙碱组成，PH5. 8 6. O。
5.根据权利要求2所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述固体分化培养基由 MS 培养基 1L、0. Img 0. 2 mg NAA、5. 0 mg 6. 0 6_BA、20 g 30g 鹿糖、8 98琼脂组成，口115.8 6.0。
6.根据权利要求2所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述生根培养基由MS培养基1L、0. 2 0. 3 mg NAA、20 g 30g蔗糖、8 9 g琼脂组成，pH5. 8 6. O。
7.根据权利要求3-6所述四倍体红心红皮萝卜的育种方法，其特征在于所述的MS培养基，以 IL 计，组成为=NH4HO3 1650mg, KNO3 1900mg, CaCl2*2H20 440mg, KH2PO4 170mg,MgSO4*7H20 370mg，FeS04*7H20 27. 8mg，Na2EDTA 37. 3mg，H3BO3 6. 2mg，MnS04*H20 16. 9mg，ZnSO4^H2O 8. 6mg，Na2Mo04*2H20 0. 25mg，CuS04 5H20 0. 025mg，CoCl2WH2O 0. 025mg，KI0.83mg，肌醇lOOmg，甘氨酸2mg，烟酸0. 5mg，维生素BI 0. lmg，维生素B6 0. 5mg和余量的无菌水。
全文摘要
本发明涉及一种萝卜的育种方法，尤其是一种四倍体红心红皮萝卜的育种方法，属于植物育种技术领域。本发明的方法主要是将灭菌后的红皮红心萝卜种子，接种到MS发芽培养基上发芽，然后将无菌苗接入含秋水仙碱的MS液体诱导培养基中进行培养后再接入到不含秋水仙碱的固体分化培养基中培养，至分化生成再生芽，切取再生芽接种至生根培养基上生根培养，经炼苗和移栽，得到再生植株。经检测，所得的四倍体红心红皮萝卜与其同源二倍体相比在植株生长的各个阶段均具优势。其有益效果是提高了红心红皮萝卜的产量的同时提高红心红皮萝卜的红色素含量，具有广阔的市场前景。
文档编号A01H4/00GK102613074SQ201210047249
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者姚悦梅, 张振超, 戴忠良, 潘永飞, 潘跃平, 秦文斌, 肖燕 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所, 镇江瑞繁农艺有限公司