专利名称：一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌的构建及其应用，具体地说，本发明涉及一株产庆大霉素Cla工程菌，应用于抗生素制造。
背景技术：
小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系统，小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌。小单孢菌是庆大霉素产生菌，庆大霉素是氨基糖苷类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是我国、乃至全世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，起抗菌作用的主要组分为C族复合物C1、C2和Cla。庆大霉素产生菌代谢产物可开发的组分十分丰富，如庆大霉素Cla是合成抗耐药菌药物依替米星(Etimicin)的前体；庆大霉素 B是进一步合成抗耐药菌药物异帕米星的母体；庆大霉素A、B、X是进一步开发抗原虫的良好药物；最新研究发现氨基糖苷类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，具有极大意义。尽管人们对小单孢菌和庆大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍，而庆大霉素仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进展， 但在小单孢菌中的应用进展缓慢。依替米星是新型半合成庆大霉素，是中国独创的抗生素一类新药，已在多国申请专利，其知识产权得到了有效保护，需求量大，是本类抗生素临床首选药物。但由于合成依替米星的母体是庆大霉素Cla (图1)。而庆大霉素Cla需要从庆大霉素产生菌的代谢产物中分离才能得到。不幸的是，到目前为止，所有庆大霉素产生菌的代谢产物是复合物，主要包括庆大霉素Cl、C2和Cla等。这些复合物化学结构相近，理化性质相似，从中分离单组份庆大霉素Cla非常困难，导致庆大霉素Cla供不应求，且生产成本居高不下，层析分离周期长，收率低，料耗大，污染严重，提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与庆大霉素Cla结构相似的副产物随时出现干扰，给依替米星产品质量控制造成了极大的不确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。若能获得专一性庆大霉素Cla产生菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的经济效益，社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障
发明内容
本发明的目的在于提供一株产庆大霉素Cla的工程菌。该工程菌为灭活卵犹功能的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 52450所述的工程菌的发酵方法，具体如下菌株GKllOl发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37°C培养10天，挖块接种于种子培养基，37°C 摇床培养观h，转速为^Orpm，然后按10%接种量转接于发酵培养基，37°C摇床培养124 h， 转速为280rpm ；所述种子培养基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉1. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%， 蛋白胨 0. 1-0. 8%,黄豆饼粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，发酵培养基玉米淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉1. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黄豆饼粉1. 0-4. O %，ΚΝ03 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6· 5-7. 5。 所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。菌株GKllOl的筛选，主要包括以下几个步骤 Α.卵犹基因置换质粒的构建；
B.置换质粒转化绛红色小单孢菌；
C.转化子的筛选；
D.工程菌组分的鉴定。基因置换的方法为PCR扩增卵犹上下游各2000 bp左右的片段作为同源交换臂， 并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间，将此三个片段同时连接到穿梭载体如pKC1139上，另外载体pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的筛选环节。其中转化是以五coli ET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。过程为先筛选同时含安普霉素抗性(AmK)和红霉素抗性(ermER)的菌株，松弛培养后再从中筛选含红霉素抗性(ermEK)但对安普霉素敏感(Ams)的菌株。发酵液组分检测采用薄层层析(TLC)，组分精确测定采用HPLC-MS法。本发明获得了一株产生庆大霉素Cla的工程菌，该工程菌为绛红色小单孢菌 (Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏编号为CGMCC No. 5245.本发明的工程菌用于产庆大霉素Cla，大大简化了生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量。达到了可大规模生产庆大霉素Cla的目标。
图1为庆大霉素化学结构式。图2为重组质粒pFD306图谱。图3为卵犹基因功能同源交换灭活(敲除)示意图。I:亲株染色体基因位置；II 与染色体KBl侧单交换；III:与染色体KB2侧单交换；IV染色体回复突变；V 与染色体双交换。图4为亲株绛红色小单孢菌S-1212与工程菌绛红色小单孢菌GKllOl代谢产物的 TLC比较分析结果；其中A为工程菌绛红色小单孢菌GKllOl代谢产物；B为亲株绛红色小单孢菌S-1212代谢产物。
图5为亲株绛红色小单孢菌S-1212代谢产物的HPLC-MS图谱。其中总离子流图谱的峰1对应的是庆大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰2，对应的是庆大霉素C2，分子量464. 3 ； 峰3，对应的是庆大霉素C2b，分子量464. 3 ；峰4，对应的是庆大霉素C2a，分子量464. 3 ；峰 5，对应的是庆大霉素Cl，分子量478. 3。图6为工程菌绛红色小单孢菌GKllOl代谢产物的HPLC-MS图谱。其中总离子流图谱的峰15对应的是庆大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰20，对应的是庆大霉素C2b，分子量 464. 3 ；未检测到庆大霉素Cl、C2和CM组分的痕迹。
具体实施例方式实施例1
本发明包括以下主要步骤 1.构建卵犹基因置换质粒
根据庆大霉素生物合成基因簇(可参考GenBank Accession Number AY524043)，分别在卵犹基因(SEQ. NO. 1)上下游设计两对引物LBl和LB2以及LB3和LB4，以出发菌株 S-1212 (周晓兰，黄建忠，，施碧红，施巧琴.影响绛红色小单孢菌 purpurea)^-\2\2孢子萌发的几个主要因子的研究.福建师范大学学报(自然科学版)， Vol. 18 No. 1，ρ72-75)的染色体DNA (CTAB法)为模板，分别进行PCR，扩增得到gntK两端的DNA序列，作为同源交换臂；上游交换臂称为KB1(LB1/LB2)，长度为2076 bp ；下游交换臂称为KB2(LB3/LB4)，长度为2044bp。以质粒pAGe为模板(朱碧银，洪文荣，严绍德，朱宝泉， 林玉双，封成军.黑暗链霉菌DNA同源重组系统的构建.生物技术通报2011 (4)，162 一 166·)，El和E2为引物，扩增抗性筛选标记基因ermE，长度为1711bp (Fig. 2)。KB1、KB2 和ermE分别经pMD19_T (TA)克隆，得到阳性质粒，依次命名为pFD301、pFD302和pFD303。 pFD303经Spe I/Xba I酶切，回收1711 bp片段，与经Xba I酶切过的pFD301(4758 bp)进行酶连，转化和筛选，得到阳性质粒，命名为PFD304 ；用)(ba I酶切pFD302，回收2048bp片段，与经)(ba I酶切过的pFD304 (6463 bp)进行酶连，筛选得到阳性质粒，命名为pFD305 ； 用Bgl II酶切pFD305,回收5801 bp片段，与经BamH I酶切过的pKC1139 (6500 bp)进行酶连，经筛选，最终得到阳性质粒，命名为PFD306 (图2)。表1实施例所涉及的引物
权利要求
1.一株产庆大霉素Cla工程菌，其特征在于，所述工程菌为灭活卵犹功能的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) GKl 101，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5245.
2.一种如权利要求1所述的工程菌的发酵方法，其特征在于，菌株GKllOl发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37°C培养10天，挖块接种于种子培养基，37°C摇床培养观h，转速为280rpm，然后按10%接种量转接于发酵培养基，37 °C摇床培养124 h，转速为280rpm;所述种子培养基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉 1. 0-2. 0%,玉米粉 0. 5-2. 5%，蛋白胨 0. 1-0. 8%,黄豆饼粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，发酵培养基玉米淀粉3. 0-6. 0%,玉米粉1. 0-2. 0%,蛋白胨 0. 1-0. 8%，黄豆饼粉 1. 0-4. 0 %，KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6. 5-7. 5。
3.如权利要求1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，涉及一种灭活gntK功能的产庆大霉素C1a的工程菌及其应用，所述工程菌为绛红色小单孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.5245，所述的工程菌用于制备抗菌药物。本发明获得了产庆大霉素C1a的工程菌，简化了生产工艺、降低了生产成本，同时还方便了产品的质量控制。
文档编号C12N1/20GK102363759SQ20111033153
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者严凌斌, 封成军, 林玉双, 洪文荣 申请人:常州方圆制药有限公司, 福州大学