专利名称：一种新的shRNA表达载体及其构建方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种新的shRNA表达载体，本载体可通过双短链或者单长链退火的方法实现低成本、高效地shRNA克隆。
背景技术：
功能缺失的表现型在寻找和验证基因和生物功能方面关系中起着重要作用。RNAi 诱发的基因沉默现象具有高效性、高特异性等特点，已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤、基因功能组学、细胞信号转导通路等方法的研究。shRNA是一种非常有前景的RNA干扰技术。传统的shRNA克隆方法，是合成两条序列不完全相同的寡核苷酸片段，将这两种寡核苷酸片段在退火形成双链后，插入用限制性内切酶双酶切得到的线性化载体，从而得到环形的DNA分子，随后将环状DNA分子转化大肠杆菌，通过筛选得到正确的基因克隆。上述方法一般需要每条链合成60碱基以上，两条链需合成碱基120nt以上。本专利中我们描述一种通过双短链或者单长链构建shRNA的新方法及其载体，可快速、高效的实现shRNA的克隆表达，尤其是其具有低成本、高构建成功率、高抑制率的优势，仅需合成50多个碱基即可实现shRNA的克隆，更适用于大规模shRNA的克隆筛选。
发明内容
本发明的目的在于对传统的shRNA克隆方法进行改造，从而提供一种新型的 shRNA克隆载体及其构建方法。具体说，本发明涉及通过双短链或者单长链退火构建shRNA 的新载体及其新方法。本发明的shRNA克隆方法包括制备合适的克隆载体、双短链或者单长链自身退火形成长双链DNA并与本发明的载体进行连接得到环形DNA分子，通过转化在大肠杆菌中进行复制扩增。其特征在于本发明的新载体采用PIII型Hl启动子并对其3’端进行了突变使其最后3_5个碱基均改变为T ；构建的shRNA采用具有回文序列的环序列，因此仅需合成两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，在退火后自身互补配对而形成长双链DNA片段；所述载体和自身退火后的DNA双链均具有碱基序列相同的粘性末端，且同为5’端或3’端的突出端。所述载体和自身退火后的DNA双链长度的粘性末端突出段为1-5个碱基，所述碱基包括A和T ；所述载体和自身退火后的DNA双链能够通过相同的粘性末端进行互补配对；根据本发明，最后还包括将连接到环状DNA分子及转化到细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。总体来说，本发明提供的载体和shRNA克隆方法，只需要合成双短链或者单长链寡核苷酸片段，自身退火后与改造后的载体通过相同的粘性末端连接，可以高效、方便、低成本地实现shRNA克隆。本发明另一方面提供了一种基因治疗载体，所述构建物含有本发明上述shRNA结构以及与所述shRNA结构相连的表达调控序列。本发明所述的shRNA基因治疗载体适用于人类细胞或组织、各种哺乳类动物细胞或组织以及转基因动物。
为了更好的理解本发明的实质，下面将结合图表、附图来说明本载体及本载体的构建方法及其适用性。图1本发明载体pshOK-basic的示意2基于本载体的环序列以及正义反义序列方向的优化图3基于本载体的两种shRNA构建方法比较图4基于本载体抗LacZ基因的shRNA对LacZ的抑制效果图5基于本载体抗Gluc基因的shRNA对Gluc的抑制效果
具体实施例方式本发明提供了一种通过双短链或者单长链寡核苷酸构建shRNA的新方法，可以高效、方便、低成本地实现shRNA克隆，以下通过实例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。实施例一 pshOK-basic克隆载体的构建采用pSuper载体为模板，PCR扩增Hl启动子序列(HlF ATAGGATCCGAACGCTGACGTCATCAAC，HlR :GCCAGATCTCCAAAAAAACGAAGAGCAAGCTTGCTCTTCCTTT GATCTGTGGTCTCATACAGAAC)并将其3端最后三个碱基全部突变为T，同时引入两个SapI酶切位点用于shRNA克隆，PCR产物纯化后采用BamHI和BglII双酶切插入到pCMV_emGFP 载体(实验室构建保存)，酶切及测序选择Hl突变启动子正向插入的正确克隆命名为 pshOK-basic (载体图谱如图1所示，序列见序列表序列1)。实施例二 shRNA结构的优化(环和茎)采用已报道对HBV有抑制作用的有效序列1856(序列为 AGGACAAACGGGCAACATACC)，分别设计不同长度回文序列的环结构考察对HBsAg和HBeAg的抑制作用。2. 1将合成的单链oligo干粉稀释至50 μ M，通过自身退火，形成带有粘性末端的双链DNA与本发明的载体进行连接得到环形DNA分子，通过转化在大肠杆菌中进行复制扩增得到质粒。2. 2于37 °C、5 % CO2、含5 %胎牛血清(Hyclone)的DMEM培养液中培养H印G2 细胞。培养至对数生长期后，将H印G2细胞接种M孔板，继续培养12-24小时，待长至 70% -90%细胞汇合后，采用GenJet转染试剂并参照说明书操作共转染HBV质粒和构建好的shRNA (质量比为1 1)。2. 3分别细胞转然后48h收集细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg ELISA检测试剂盒 (科华生物工程股份有限公司)说明书操作步骤检测(结果如图2所示)。
实施例三两种不同shRNA构建方法的比较比较单长链寡核苷酸自身退火和双短链寡核苷酸自身退火形成长双链寡核苷酸用于克隆shRNA的效率和正确率。采用已报道对HBV有抑制作用的有效序列1856(序列为 AGGACAAACGGGCAACATACC)，采用实施例三优化的回文环序列TTCTAGAA，单长链寡核苷酸合成后按实施例二方法自身退火形成长双链寡核苷酸，双短链寡核苷酸合成后首先用T4多聚核苷酸激酶和ATP将两条短链的5’端磷酸化后再退火形成长双链寡核苷酸，然后分别与酶切好的pshOK-basic载体连接，比较克隆数以确定连接效率，通过测序确定正确率，经验证两种方法的正确率平均都达到了 90%以上，但通过双短链寡核苷酸退火的方法连接效率明显较高(结果如图3所示)。实施例四基于本载体抗LacZ基因的shRNA对LacZ的抑制效果设计并构建针对LacZ基因的shRNA，与LacZ的表达载体pAAV_LacZ以1 1的比例共转染G2细胞，在4 采用β -半乳糖苷酶原位染色试剂盒按照说明书操作步骤进行染色，并在普通光学显微镜下观察(结果如图4所示)。实施例五基于本载体抗Gluc基因的shRNA对Gluc的抑制效果设计并构建针对Gluc基因的shRNA，与Gluc的表达载体pCMV-Gluc以1 1的比例共转染G2细胞，4 后检测细胞上清中Gluc的含量(结果如图5所示)。
权利要求
1.一种用于shRNA介导基因沉默的shRNA构建载体。其特征在于采用PIII型Hl启动子并对其3’端进行了突变使其最后3-5个碱基均改变为T ；含有两个SapI (或BspMI，BbvII, BsmI)酶切位点进行shRNA构建。
2.—种shRNA的克隆方法，包括仅需合成两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，在退火后自身互补配对而形成长双链DNA片段后，插入用限制性内切酶酶切得到的线性化的载体，得到环形的DNA分子。随后将环状DNA分子转化细菌，通过筛选得到正确的基因克隆。
3.根据权利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于两条短链或者一条长链寡核苷酸片段，两条同种链在自身退火后能够形成长双链寡核苷酸片段。
4.根据权利要求2所述的shRNA克隆方法，其特征在于，退火形成的DNA片段能够和权利要求1中的酶切后载体通过互补的粘性末端连接。
5.根据权利要求1所述的载体和权利要求2所述的方法，其构建的shRNA采用具有回文序列的环序列。
6.一种基因治疗载体，其特征在于含有权利要求1中shRNA结构相连的表达调控序列以及权利要求2中的shRNA结构。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于新的shRNA的克隆表达载体及其构建方法与应用。所述的载体包括自主改造后的载体和酶切后的载体片段，及优化好的环碱基序列。所述的克隆方法包括合成双短链或单长链通过自身退火形成长双链DNA，将酶切后的载体和长双链DNA通过互补的粘性末端连接得到环形的DNA，并将其转化得到正确的基因克隆等步骤。利用本发明提供的载体shRNA克隆方法，采用优化后的回文结构环序列，且只需合成双短链或单长链，不仅提高了shRNA的疗效，而且能够快速，高效，低成本地克隆，可取代传统的克隆方法来实现shRNA克隆。
文档编号C12N15/10GK102533826SQ20111033103
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者张秀娟, 李丹丹, 李英, 王升启, 王学军, 胡伟, 谢佩雯 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所