专利名称：一种快速分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于组 织工程领域，涉及一种分离脂肪间充质干细胞的试剂盒、该试剂盒的应用以及一种分离脂肪间充质干细胞的方法。
背景技术：
脂肪间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，具有来源自体，取材广泛、易于采集、保存和运输、无异体排斥、避免伦理争议等诸多优点。流式细胞仪分析发现脂肪间充质干细胞高表达间质细胞标志(⑶44、⑶105)、整合素受体(⑶29、⑶49b、⑶49c、⑶51)，不表达造血系标志(⑶34、⑶45)和内皮细胞标志⑶31。脂肪间充质干细胞在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞以及脂肪细胞等。目前人脂肪间充质干细胞在组织工程皮肤以及细胞治疗等临床应用研究中已逐渐深入，并已显示出广阔的应用前景。目前，对脂肪间充质干细胞的分离培养、扩增还没有统一的标准，存在纯度低、原代培养时间长等缺点。各种类型的成纤维成体干细胞扩增一般在2 3天开始进入指数式生长，相差不大，而原代细胞由于组织来源不同，出现细胞克隆时间差异较大，所以，原代细胞传代时间是分离得到目的细胞的关键。
发明内容
为了解决脂肪间充质干细胞分离的纯度、数量和原代培养时间问题，本发明提供了一种分离脂肪间充质干细胞的试剂盒。此试剂盒能有效纯化哺乳动物脂肪间充质干细胞，加快原代细胞扩增速度。获得大量脂肪间充质干细胞，以利于进行下一步的实验研究。根据本发明的一个方面，本发明的分离脂肪间充质干细胞的试剂盒包括洗涤液，细胞培养液A，细胞培养液B和细胞消化液，其中:所述细胞洗涤液为生理盐水；所述细胞培养液A 为含 100ng/ml LIF(Sigma，L5158)与 100ng/ml bFGF (Sigma,F5392)细胞因子的 Knockout-DMEM 液体培养基(Gibco，12660012)；所述细胞培养液B为胎牛血清；所述细胞消化液为胶原酶I型酶液(Sigma，C-0130)。根据本发明的一个方面，所述脂肪间充质干细胞源自哺乳动物。根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是无菌的。根据本发明的一个方面，所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液为独立包装。根据本发明的一个方面，用于脂肪间充质干细胞的培养的细胞培养液是将细胞培养液A与细胞培养液B按照4:I体积比配制的细胞培养混合液。根据本发明的一个方面，所述的细胞洗涤液含0.9%的氯化钠的，所述细胞消化液可为质量/体积百分比浓度为0.2 %。本发明的另一目的 在于提供了一种分离脂肪间充质干细胞的方法。该方法用试剂盒内细胞消化液处理脂肪组织，经细胞培养液A和B的原代培养，最终获得分离的脂肪间充质干细胞。根据本发明的一个方面，所述分离脂肪间充质干细胞的方法可通过下述步骤实现的:本发明的方法采用胶原酶I型酶有效处理脂肪蛋白胶质，利用细胞因子(LIF、bFGF)组合对脂肪间充质干细胞的促进作用，从而确保了原代细胞分离数量和减少原代培养时间。根据本发明的一个方面，所述分离脂肪间充质干细胞的方法可包括:1、脂肪预处理:无菌收集脂肪，浸没于含1%双抗(青链霉素)的细胞培养液(A和B)中，玻璃容器密封运输至实验室；生物安全柜中剪取约Ig脂肪，用生理盐水清洗脂肪中的血污。用剪刀剪碎脂肪组织成糜状。2、分离细胞:将剩余脂肪组织剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入20ml细胞消化液，混匀37°C过夜消化约6小时。离心，用细胞培养液重悬细胞，接种原代细胞于0.2%明胶包被的培养瓶中，置37°C、5% C02培养箱中培养。72小时候，可见贴壁成纤维状细胞，呈漩涡式生长(见图1)。
图1.分离得到的脂肪间充质干细胞
具体实施例方式下面结合实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但是并不以此来限制本发明。实施例1、用于分离脂肪间充质干细胞的试剂盒的配制1、洗涤液:取9g NaCl以去离子水定容至1000ml，高压灭菌制得0.9%的氯化钠洗涤液，放置在4V冰箱内备用。2、细胞培养液:含 100ng/ml LIF 与 100ng/ml bFGF 细胞因子的 Knockout-DMEM 液体培养基和无菌胎牛血清培养液按照4:I的体积比混合配制细胞培养中所用细胞培养混合液。3、细胞消化液:配制质量/体积百分比浓度为0.2%的胶原酶I型酶溶液。实施例2、用于分离脂肪间充质干细胞的试剂盒的分装试剂盒的规格为I次/盒，每盒中各组分的量:洗涤液I瓶(IOOml/瓶)，细胞培养液Al瓶(80ml/瓶)，细胞培养液BI瓶(20ml/瓶)，细胞消化液I瓶(IOOml/瓶)。接上述剂量对试剂盒中各组分进行独立包装，得到分离脂肪间充质干细胞的试剂盒。
实施例3、脂肪间充质干细胞的分离与扩增培养无菌收 集脂肪，浸没于含1%双抗(青链霉素)的细胞培养液(A和B)中，玻璃容器密封运输至实验室；生物安全柜中剪取约Ig的脂肪，用生理盐水清洗脂肪中血管中的血污。将脂肪组织剪碎成肉糜状，转移到离心管中，加入20ml细胞消化液，混匀37°C过夜消化约6小时。离心，用细胞培养液重悬细胞，接种原代细胞于0.2%明胶包被的培养瓶中，置37°C>5% C02培养箱中培养。
权利要求
1.一种分离脂肪间充质干细胞的试剂盒，包括: 洗涤液，其为含0.9%的氯化钠的生理盐水； 培养液A，其为含100ng/ml LIF与100ng/ml bFGF细胞因子的Knockout-DMEM液体培养基; 培养液B，其为胎牛血清； 细胞消化液，其为胶原酶I型酶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是无菌的。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述洗涤液、培养液A、培养液B以及细胞消化液是独立包装。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞源自哺乳动物。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述培养液B的技术指标如下:pH(7.0-7.5)、总蛋白含量(3-3.5/100ml)、血红蛋白(彡 20mg/100ml)。
6.权利要求1所述的试剂盒 ，其特征在于:所述培养液A与培养液B以4:1的体积比来提供。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述生理盐水为含0.9%的氯化钠溶液，所述细胞消化液为质量/体积百分比浓度0.2%的胶原酶I型酶液。
8.一种分离脂肪间充质干细胞的力法，包括: (1)利用洗涤液冲洗脂肪中中的血污，用解剖刀在脂肪一端(离顶端Icm处)圆周划开外表皮，用夹子固定脂肪此端，用两把镊子用力撕下脂肪外表皮，再分离两根动脉，最后将静脉内皮剔除； (2)将剩余脂肪组织剪碎成肉糜状，转移到离心管中，随后用细胞消化液消化(37°C消化6小时); (3)吸出离心管中消化后的液体。除去其他组织及杂质。
(4)吸出的液体经离心机离心(2500rpm，5分钟)。离心后，倒出培养基，用细胞培养液重悬细胞。
(5)接种的原代细胞于0.2%明胶包被的培养瓶中，置37°C、5% C02培养箱中培养。
其中洗涤液为生理盐水； 细胞培养混合液为按照9:1体积比来配制的培养液A与培养液B，其中培养液A为Knockout-DMEM液体培养基，培养液B为胎牛血清； 以及细胞消化液胶原酶I型酶液。
(6)每天观察细胞贴壁生长情况。细胞多数贴壁后全量换液，除去未贴壁细胞和杂质，以后每3 4天半量换细胞培养液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(5)中，采用每106个细胞接种到25m2培养瓶中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤￠)中，24小时细胞多数贴壁后全量换液，除去未贴壁细胞和杂质，。
全文摘要
本发明提供了一种分离脂肪间充质干细胞的试剂盒及方法。该试剂盒包括洗涤液，细胞培养液A，细胞培养液B，细胞消化液，其中洗涤液为生理盐水(含0.9％的氯化钠)；细胞培养液A为含100ng/ml LIF与100ng/ml bFGF细胞因子的Knockout-DMEM液体培养基；细胞培养液B为胎牛血清；细胞消化液为质量/体积百分比浓度为0.2％的胶原酶I型酶液。与传统分离培养方法相比，采用此试剂盒得到的细胞纯度高，增殖更快，一般7天即可完成原代细胞培养。将原代细胞传代，利用培养液进行培养，一般2-3天细胞密度即可达到90％，为利用脂肪间充质干细胞进行进一步实验研究提供了丰富的来源。
文档编号C12N5/0775GK103087982SQ201110330948
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司