专利名称：一种检测egfr基因突变的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测EGFR基因突变的方法及
试齐U盒。
背景技术：
表皮生长因子受体(印idermal growth factor rec印tor，EGn )是一种由原癌基因C-(erbB)-2编码的跨膜糖蛋白。它由1186个氨基酸残基组成，分为胞外段、跨膜段和胞内激酶活性段。在EGF作用下，激活的EGFR可刺激肿瘤的生长与进展，包括促进增殖、血管生成、浸润、转移和抑制凋亡。临床研究显示，人类许多的肿瘤都存在一定程度的EGFR高表达，并与患者的病情进展、放化疗敏感性及预后相关。EGFR已成为相关肿瘤尤其是肺癌化疗研究的重要靶标。肺癌发病率为0. 4-1/1000,占肿瘤死亡病例的1/3-1/4，目前肺癌的治疗是以手术为主，其他肺癌治疗措施有放射治疗、化学治疗、免疫治疗、中医中药治疗等。虽然化疗研究使肿瘤的治疗，尤其是5年生存率有了很大提高，但不同肿瘤因发病机理不同，对抗肿瘤药反应差异极大。抑制EGFR活性的EGFR-TK拮抗剂——吉非替尼(gefitinib，ZD1839， Iressa)可竞争细胞表面的表皮生长因子受体酪氨酸激酶(EGFR-TK)催化区域上的ATP结合点，已被FDA批准用于晚期非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者经化疗后继续恶化者的单用疗法。最新研究表明，EGFR的酪氨酸激酶域的体细胞突变与NSCLC 患者对吉非替尼的敏感性相关。这些突变均发生在酪氨酸激酶域的ATP结合域附近，88% 表现为集19号外显子的非移码缺失突变和21号外显子的单碱基替代突变。而对无EGFR 突变的肺腺癌患者或其它类型的肺癌患者，吉非替尼不仅无疗效，还产生严重的不良反应， 这一发现已得到了美国国立卫生研究所确认。因此，通过检测EGFR突变，在大量遗传异质性样本中筛选EGFR-TK拮抗剂有疗效的患者，对肺癌的个体化临床治疗具有一定的指导意义。目前，许多科研机构和生物科技公司正致力于基因突变的研究，已开发了许多有效的检测方法，如PCR-SSCP、TGGE, DGGE等，但这些方法均不适用于涉及体细胞突变(稀有突变)的疾病的检测。有检测机构推出的肺癌体细胞EGFR突变基因相关检测方法，采用单细胞PCR与常规DNA测序相结合。然而，在技术层面上分析，因该方法需要显微镜下选取特定的肿瘤细胞，再对其DNA进行分析，操作复杂，随机性较大，且所需仪器昂贵。该方法的缺点是耗时多、花费大、效率较低，故难以大面积推广应用。常规DNA测序，对稀有突变的分辨率不到10% (10-1)，常规PCR包括目前有学者采用 TaqMan PCR, PNA-LNA(peptide nucleic acid-locked nucleic acid)PCR 及 Mutant-enriched PCR等方法应用在EGFR的突变检测中，对稀有突变的分辨率也不到 1/1000 (10-3)。因此，对于这类EGFR基因的稀有频率的体细胞突变虽在肿瘤发生中具有十分重要的意义，但其相应的检测方法却是当代个体化医药学中亟待解决的难题。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种检测EGFR基因突变的方法及试剂盒，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，以及条带的大小判断EGFR基因型，使得EGFR基因突变的检测更快速、准确、简便、经济。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ IDNo. U SEQ ID No. 2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示SEQ ID No. 1 :5，TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3‘；SEQ ID No. 2 5' -CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3‘；SEQ ID No. 3 5' -AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3，。上述技术方案中，正向引物SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和反向引物序列SEQID NO. 3检测的位点分别对应EGFR基因19号外显子的15nt缺失突变和18nt缺失突变，正向引物三末端第二个、第三个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基。上述技术方案中，所述常规PCR组件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNIPs。上述技术方案中，所述检测EGFR基因突变的试剂盒还包括两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒。所述两个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子delE746_A750 (del 2235-2249) 的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子del L747_P753insS (del 2240-2257)的突变序列。所述一个野生型阴性对照质粒为pGEM_T质粒载体插入包含EGFR 基因19号密码子野生序列。采用上述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因的2个缺失点突变(19号密码子15nt缺失突变，ISnt缺失突)的方法，包括以下步骤(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA ；(2)以步骤⑴所得样本基因组DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增， 根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有EGFR基因的突变，所述基因的突变包括15nt缺失突变和18nt缺失突变；判断规则为如果出现扩增产物23^p，则表明样本中含有上述 15nt缺失突变；如果出现扩增产物228bp，则表明样本中含有上述18nt缺失突变；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述2个缺失突变中的任意一种。上述技术方案中，所述15nt缺失突变为EGFR基因19号外显子的缺失突变del E746-A750 (del 2235-2249)，所述18nt缺失突变为EGFR基因19号外显子的缺失突变del L747-P753insS(del 2240-2257)。上述技术方案中，进行多重PCR扩增时，每25yL的多重PCR扩增体系包括 1 μ L样本基因组DNA(40ng/ μ L), 2. 5 μ L IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1 μ L反向引物 (10 μ Μ)，两条正向引物(10 μ Μ)各 0.5yL，0.2yL Pfu 酶(2. 5U/μ L)，0. 4 μ L dNTPs (各 10 μ M)，剩下加水补足；多重PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性20秒，68°C退火 20秒(退火温度每个循环递减1°C )，72°C延伸30秒，共10个循环；95°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。进一步的技术方案中，PCR扩增结束后采用常规技术进行纯化和电泳鉴定。本发明的基本原理为由于低保真酶对突变的分辨率仅为10_4，而高保真酶的分辨率为10_7，远远大于低保真酶对突变的识别能力。采用高保真聚合酶与硫化修饰引物构成的分子开关系统，具备对突变位点高度辨认的能力。对三末端错配的硫化修饰碱基的特异性引物而言，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，致使高保真聚合酶分子中无法酶解错配碱基，造成“关”闭DNA聚合反应的效果；对于配对的引物，高保真聚合酶则继续完成 DNA聚合反应，形成“开”的效应。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，满足了突变分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。具体地，当待测样本为EGFR野生型时，两条正向引物的三末端第二个和第三个碱基与EGFR野生型模板序列不配对，且硫化修饰，利用高保真酶的分子开关效应，无目的产物扩增；当待测样本中至少含有EGFR的两个缺失突变中的一个时，两条正向引物的三末端第二个和第三个碱基在与 EGFR突变模板互补的情况下，可以扩增出相对应的目的产物。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，具备快速的优点，因采用多重PCR技术，在2小时内可检测出三种EGFR基因突变位点， 与临床检测金标准序列测定至少所需5小时相比，检测时间大大缩短。2.采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，具备敏感性高的优点。本发明所述试剂盒对突变模板最低检测拷贝数可达10拷贝数， 且可在多个平台如荧光定量PCR中应用(如图4，5，6，7)。3.本发明所述检测方法简便、成本低，有利用临床使用和推广。
图1为实施例一中含有EGFR基因19号外显子野生型DNA序列的质粒测序图谱；图2为实施例一中含有EGFR基因19号外显子15nt缺失突变型DNA序列的质粒测序图谱；图3为实施例一中含有EGFR基因19号外显子18nt缺失突变型DNA序列的质粒测序图谱；图4为实施例一中分子开关在15nt缺失突变型质粒的敏感性电泳图；图5为实施例一中分子开关在18nt缺失突变型质粒的敏感性电泳图；图6为实施例一中分子开关在15nt缺失突变型质粒的敏感性荧光定量PCR扩增曲线；图7为实施例一中分子开关在18nt缺失突变型质粒的敏感性荧光定量PCR扩增曲线；图8为实施例二中8个肺癌组织DNA模板的分子开关检测电泳图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一用三条特异性引物检测EGFR野生型质粒样本、EGFR突变型质粒样本。
一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQID No. 3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示SEQ ID No. 1 :5，-TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3‘；SEQ ID No. 2 5' CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3‘；SEQ ID No. 3 5' -AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3，；其中，正向引物SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和反向引物序列SEQ ID NO. 3检测的位点分别对应EGFR基因19号外显子的15nt缺失突变和18nt缺失突变，正向引物三末端第二个、第三个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基；所述常规PCR组件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液， dNTPs述检测EGFR基因突变的试剂盒还包括两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒。所述两个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，PGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子del E746-A750 (del 22；35_2对9)的突变序列，pGEM_T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子delL747-P753insS(del 2240-2257)的突变序列。 所述一个野生型阴性对照质粒为PGEM-T质粒载体插入包含EGFR基因19号密码子野生序列。1)用试剂盒中提供的两个检测位点的阳性对照突变质粒，和一个野生型阴性对照质粒，测序验证序列正确。测序结果如图1对应野生型阴性对照质粒的序列测定结果，图2 对应EGFR基因19号外显子15nt缺失突变质粒的序列测定结果，图3对应EGFR基因19号外显子18nt缺失突变质粒的序列测定结果。2)将两个突变质粒等比稀释成ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、10拷贝数/ μ L浓度梯度作为PCR 扩增模板，分别正向引物SEQ ID No. USEQ ID No. 2和反向引物SEQ ID No. 3，对两个质粒模板进行PCR扩增。每25 μ L的PCR扩增体系包括1 μ L质粒DNA，2. 5 μ L IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，IyL反向引物(10 μ Μ)，两条正向引物(10 μ Μ)各0. 5 μ L，0. 2 μ L Pfu酶 (2. 5U/yL),0. 4yL dNTPs (各10 μ Μ)，剩下加水补足；PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性20秒，68°C退火20秒(每个循环递减1°C )，72°C延伸30秒，共10个循环； 95°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。3)PCR产物采用凝胶电泳鉴定。结果如图4示引物SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 3 检测15nt缺失突变质粒模板梯度稀释的电泳结果。如图5示引物SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3检测ISnt缺失突变质粒模板梯度稀释的电泳结果。结果显示试剂盒最低可检测15nt 缺失突变质粒模板的起始模板数为3X IO3拷贝；试剂盒最低可检测18nt缺失突变质粒模板的起始模板数为10拷贝。4)将两个突变质粒等比稀释成105、104、103、102、10拷贝数/yL浓度梯度作为 PCR扩增模板，分别正向引物SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2和反向引物SEQ ID No. 3，对两个质粒模板进行荧光定量PCR扩增。每25 μ L的PCR扩增体系包括1 μ L质粒DNA，1. 5 μ L 20 X EvaGreen荧光染料，2. 5μ L IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1 μ L反向引物(10 μ Μ)， 两条正向引物(ΙΟμΜ)各 0. 5μ L，0. 2μ L Pfu 酶(2. 5U/μ L)，0. 4 μ L dNTPs (各 10 μ Μ)，乘 Ij下加水补足；PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性20秒，68°C退火20秒(每个循环递减1°C )，72°C延伸30秒，共10个循环；95°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸30 秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。5)直接观测荧光定量PCR结果。结果如图6示引物SEQ ID No. 1和SEQID No. 3 检测15nt缺失突变质粒模板梯度稀释的荧光定量PCR结果。如图7示引物SEQ ID No. 2 和SEQ ID No. 3检测ISnt缺失突变质粒模板梯度稀释的荧光定量PCR结果。结果显示试剂盒在荧光定量PCR中最低可检测15nt缺失突变质粒模板的起始模板数为IO3拷贝；试剂盒在荧光定量PCR中最低可检测18nt缺失突变质粒模板的起始模板数为10拷贝。实施例二 检测EGFR野生型样本、EGFR突变型的样本。1)用常规方法提取人肺癌组织基因组DNA。2)采用试剂盒引物对人肺癌组织基因组DNA进行缺失突变PCR检测。每25 μ L 的多重PCR扩增体系包括1 μ L样本基因组DNA，2. 5 μ L IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液， 1 μ L反向引物，两条正向引物各0. 5 μ L，0. 2 μ L Pfu酶，0. 4 μ LdNTPs，剩下加水补足；多重 PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95 °C变性20秒，68 °C退火20秒(每个循环递减1°C )， 72°C延伸30秒，共10个循环；95°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果如图8所示，8例肺癌组织基因组DNA 中筛查到3例EGFR基因15nt缺失突变。
权利要求
1.一种检测EGFR基因突变的试剂盒，包括常规PCR组件，其特征在于，还包括特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，并且每一条正向引物的三末端第二个、第三个碱基为硫化修饰碱基；其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No. USEQ ID No. 2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示SEQ ID No. 1 :5’ TTCCCGTCGCTATCAAAACC-3‘；SEQ ID No. 2 :5’ -CGTCGCTATCAAGGAATCGAT-3‘；SEQ ID No. 3 :5，-AGTGCTGTCTCTAAGGGGC-3，；所述常规PCR组件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。
2.采用权利要求1所述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA;(2)以步骤⑴所得样本基因组DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据 PCR扩增的结果判断样本中是否含有EGFR基因的突变，所述基因的突变包括15nt缺失突变和ISnt缺失突变；判断规则为如果出现扩增产物23^p，则表明样本中含有上述15nt 缺失突变；如果出现扩增产物228bp，则表明样本中含有上述ISnt缺失突变；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述2个缺失突变中的任意一种。
3.根据权利要求2所述检测EGFR基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在EGFR基因突变的方法，其特征在于，进行多重PCR扩增时，每25 μ L的多重PCR扩增体系包括1 μ L 样本基因组DNA，2. 5yL IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1 μ L反向引物，两条正向引物各 0. 5μ L，0. 2μ LPfu酶，0. 4μ LdNTPs，剩下加水补足；多重PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性20秒，68°C退火20秒，退火温度每个循环递减1°C，72°C延伸30秒，共10个循环；95°C变性20秒，55°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
4.如SEQIDNo.1所述的核苷酉I序列。
5.如SEQIDNo.2所述的核苷酉I序列。
6.如SEQIDNo.3所述的核苷酉I序列。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种利用PCR扩增检测EGFR基因突变的方法及试剂盒，包括常规PCR组件，特异性引物；所述特异性引物包括两条正向引物和一条反向引物，其中两条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ IDNo.3所示核苷酸序列。然后利用电泳分离PCR扩增的目的产物条带的有无，来判断EGFR基因是否存在15nt缺失突变和18nt缺失突变。采用本发明所述检测EGFR基因突变的试剂盒和检测方法检测EGFR基因突变时，快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。
文档编号C12N15/11GK102367479SQ20111033079
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者姬云, 廖端芳, 张佳, 李凯, 肖莉, 陈琳玲 申请人:苏州科贝生物技术有限公司