专利名称：一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测κ-ras基因突变的方法及试剂盒。
背景技术：
K-ras基因是重要的原癌基因，K-ras基因突变使ras蛋白一直处于激活状态，刺激细胞不断的生长或分化，最终导致细胞的恶性转化。大约30%的人类肿瘤细胞中出现 K-ras基因突变。Bosetal分析了人体肿瘤中K-ras基因点突变的发生率，胰腺癌82%，结肠癌43%，肺癌30% c,甲状腺癌四％，膀胱、肝、肾和子宫癌10%或低于10%。Mok等报道交界瘤中，K-ras突变发生率为48%，突变分别发生于12号密码子及13号密码子。直结肠癌 K-ras基因点突变率达40% -50%以上，且点突变几乎皆位于12，13，61号密码子，其中大多数点突变位于12号密码子。Pontieri-Lewis等研究证实约50%的大肠癌组织中检测出 K-ras基因突变，其中约80%的点突变位于K-ras基因12号密码子，另约15%发生在K-ras 基因13号密码子。K-ras基因突变的位点最常见于第12，13号密码子，可导致p21-ras蛋白的生长信号的异常变化。过度的生长信号可刺激细胞生长和增殖从而导致了癌症的发生。2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果，即K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版 (2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，二是只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。国家卫生部于2010年10 月14日发表了《结直肠癌诊疗规范O010版)》(卫办医政发0010)165号)。该规范明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱必妥、帕尼单抗治疗前，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出当K-ras 基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。综上所述检测K-ras基因突变的情况不仅仅有助于肿瘤的早期诊断及预防， 也有利于肿瘤患者的临床治疗。准确且迅速的诊断出K-ras基因有无12，13号密码子突变对肿瘤的早期诊断及预后有着重要的意义。目前，主要用于基因突变检测的方法包括如下几种(1)利用单碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点；(2)利用单碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响；C3)利用单碱基变异对核酸分子杂交的影响；(4)利用单碱基变异对核酸分子在电场中迁移速度的影响；( 直接测定单碱基变异。其中第一类的代表方法为限制性内切酶酶解片段长度多态性，这一方法具有简便、经济和十分可靠的特点，但这一方法的显著弱点是仅能用于研究小部分涉及了限制性内切酶酶解位点变化的突变，且该类方法难以直接应用于高通量平行分析。另一类种类繁多且获得广泛应用的突变检测方法，是碱基特异引物延伸反应，包括双向引物延伸反应，即应用碱基特异性引物与常规的多聚酶链式反应相结合、引物延伸反应与连接酶相结合、引物延伸反应与杂交分析相结合等。所有这些方法的共同点是使用了无校正功能的DNA聚合酶。上述不同方法所得的假阴性高低各不相同，但其共用的无校正功能的低保真聚合酶使所有这一类方法具有其结构上的缺陷，即无可避免地产生较高的假阳性。而目前常规使用的Sanger酶法测序即双脱氧核苷酸介导的单碱基延伸反应，对突变含量较低的相嵌体、突变较少的线粒体异质体、体细胞突变和频态分布较低的DNA池分析均难以应用。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，以及条带的大小判断K-ras基因型，可快速、准确、简便、经济地判断待测样本是否存在K-ras基因的3个热点突变12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT, 13号密码子GGC-GAC。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No. USEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 PJf 示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示SEQ ID No. 1 :5，-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3‘；SEQ ID No. 2 5' -TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3‘；SEQ ID No. 3 5' -TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3‘；SEQ ID No. 4 5' -TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3，。上述技术方案中，正向引物SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3和反向引物序列SEQ ID NO. 4检测的位点分别对应12号密码子GGT-GAT、GGT-GTT、13号密码子GGC-GAC， 正向引物三末端第二个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基。上述技术方案中，所述常规PCR组件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNIPs。上述技术方案中，所述检测K-ras基因突变的试剂盒还包括三个检测位点的阳性对照突变质粒，所述三个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，PGEM-T质粒载体插入包含 K-ras基因12号密码子GGT-GAT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K_ras基因12号密码子GGT-GTT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K_ras基因13号密码子GGC-GAC的突变序列。采用上述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因的3个热点突变(12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT, 13号密码子GGC-GAC)的方法，包括以下步骤(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA或外周血游离DNA ；(2)以步骤(1)所得样本基因组DNA或外周血游离DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有K-ras基因的3个热点突变中的至少一种；判断规则为如果出现扩增产物，则表明样本中含有上述3个热点突变中的至少一种；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述3个热点突变中的任意一种；所述3 个热点突变为12号密码子GGT-GAT突变，12号密码子GGT-GTT突变，13号密码子GGC-GAC
4突变。上述技术方案中，进行多重PCR扩增时，每25 μ L的多重PCR扩增体系包括lyL 模板^)ι^/μυ，2. 5yL IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1. 5 μ L反向引物(10 μ Μ)，三条正向引物(ΙΟμΜ)各 0. 5μ L，0. 2μ L Pfu 酶(2. 5U/μ L)，0. 4 μ LdNTPs (各 10 μ Μ)，剩下加水补足；多重PCR反应条件为95°C预变性5分钟，95°C变性20秒，68°C退火20秒(退火温度每个循环递减1°C )，72 °C延伸30秒，共10个循环；95 °C变性20秒，59 V退火20秒，72 °C 延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。进一步的技术方案中，PCR扩增结束后采用常规技术进行纯化和电泳鉴定。本发明的基本原理为由于低保真酶对突变的分辨率仅为10_4，而高保真酶的分辨率为10_7，远远大于低保真酶对突变的识别能力。采用高保真聚合酶与硫化修饰引物构成的分子开关系统，具备对突变位点高度辨认的能力。对三末端错配的硫化修饰碱基的特异性引物而言，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，致使高保真聚合酶分子中无法酶解错配碱基，造成“关”闭DNA聚合反应的效果；对于配对的引物，高保真聚合酶则继续完成 DNA聚合反应，形成“开”的效应。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，满足了突变分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。具体地，当待测样本为K-ras野生型时，三条正向引物的三末端第二个碱基与K-ras野生型模板序列不配对，且硫化修饰，利用高保真酶的分子开关效应，无目的产物扩增；当待测样本中至少含有K-ras 的三个热点突变中的一个时，三条正向引物的三末端第二个碱基在与K-ras突变模板互补的情况下，可以扩增出相对应的目的产物。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.采用本发明所述检测K-ras基因突变的试剂盒和检测方法检测K-ras基因突变时，具备快速，准确、方法简单、成本低的优点，因采用多重PCR技术，在2小时内可检测出三种K-ras基因突变位点，与临床检测金标准序列测定至少所需5小时相比，检测时间大大缩短；本发明所述试剂盒对突变模板最低检测拷贝数可达IO2拷贝数，且出现假阳性的检测起始模板拷贝数为106，远高于临床样本基因组DNA起始模板IO4拷贝数(如图4)；本发明所述试剂盒在检测临床肿瘤样本中突变检出率，经测序验证结果一致(如图幻。由于上述优点，有利用临床使用和推广。
图1为实施例一中K-ras野生型DNA测序图谱；图2为实施例二中K-ras 12号密码子GGT-GAT或GGT-GTT DNA测序图谱；图3为实施例二中K-ras 13号密码子GGC-GAC测序图谱；图4为实施例二中分子开关敏感性与特异性的电泳图；图5为实施例二中9个肿瘤组织DNA模板的分子开关检测电泳图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一制备K-ras野生型及突变型质粒DNA，具体步骤如下1)用常规方法提取人全血样本基因组DNA，DNA测序证明样本为k_ras野生型，测序结果如图1所示。2)设计并制备k-ras基因12号及13号密码子的三个点突变模板的引物分别为引物A对和引物对B，引物对C和引物对D，引物对E和引物对F，序列如下其中，引物对A包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T3k_rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对B包括正向引物T4k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，扩增突变模板下游引物；引物对A和引物对B扩增k-rasl2号密码子GGT-GTT的突变模板。其中，引物对C包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T5k_rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对D包括正向引物T6k-rasmut和反向引物T2k-rasmut ；扩增突变模板下游引物；引物对C和引物对D扩增k-rasl2号密码子GGT-GAT的突变模板。其中，引物对E包括正向引物Tlk-rasmut和反向引物T7k_rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对F包括正向引物T8k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，扩增突变模板下游引物；引物对E和引物对F扩增k-ras12号密码子GGT-GAT的突变模板。具体的引物序列
请参见下表
权利要求
1.一种检测κ-ras基因突变的试剂盒，包括常规PCR组件，其特征在于，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，并且每一条正向引物的三末端第二个碱基为硫化修饰碱基；其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No. 4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示SEQ ID No. 1 :5’ -TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3‘；SEQ ID No. 2 :5’ -TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3‘；SEQ ID No. 3 :5’ -TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3‘；SEQ ID No. 4:5’ -TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’ ；所述常规PCR组件包括高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。
2.根据权利要求1所述检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测K-ras基因突变的试剂盒还包括三个检测位点的阳性对照突变质粒，所述三个检测位点的阳性对照突变质粒分别为pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GAT的突变序列， pGEM-Τ质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GTT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因13号密码子GGC-GAC的突变序列。
3.采用权利要求1所述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA或外周血游离DNA；(2)以步骤(1)所得样本基因组DNA或外周血游离DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有K-ras基因的3个热点突变中的至少一种；判断规则为如果出现扩增产物，则表明样本中含有上述3个热点突变中的至少一种；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述3个热点突变中的任意一种；所述3 个热点突变为12号密码子GGT-GAT突变，12号密码子GGT-GTT突变，13号密码子GGC-GAC 突变。
4.根据权利要求3所述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因突变的方法，其特征在于，进行多重PCR扩增时，每25 μ L的多重PCR扩增体系包括1 μ L 模板，2. 5 μ L IOX含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1. 5 μ L反向引物，三条正向引物各0. 5 μ L， 0. 2yL Pfu酶，0.4yL dNTPs，剩下加水补足；多重PCR反应条件为95°C预变性5分钟， 95°C变性20秒，68°C退火20秒，退火温度每个循环递减1°C，72°C延伸30秒，共10个循环； 95°C变性20秒，59°C退火20秒，72°C延伸30秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
5.如SEQID No. 1所述的核苷酸序列。
6.如SEQID No. 2所述的核苷酸序列。
7.如SEQID No. 3所述的核苷酸序列。
8.如SEQID No. 4所述的核苷酸序列。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了一种利用PCR扩增检测K-ras基因突变的方法及试剂盒，包括常规PCR组件，特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。然后利用电泳分离PCR扩增的目的产物条带的有无，来判断K-ras基因是否存在12号密码子的GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC三个热点突变中的至少一个。采用本发明所述检测K-ras基因突变的试剂盒和检测方法检测K-ras基因突变时，快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。
文档编号C12N15/11GK102399872SQ20111033079
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者姬云, 张佳, 李凯, 王伟大, 王庆琳, 肖莉 申请人:苏州科贝生物技术有限公司