专利名称：一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及 生物医学技术领域，特别是涉及一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法及应用。
背景技术：
肌肉间充质干细胞是在成体骨骼肌组织中发现的在创伤后重建肌肉组织的前体细胞，有关骨骼肌成肌细胞的研究较早并有较多的动物和临床研究。成肌细胞容易识别、培养和繁殖，这使其成为临床使用的最佳选择。成肌细胞具有多向分化潜能，在体外能分化成脂肪细胞，并且具有成骨能力。大鼠成肌细胞能否向神经细胞转分化，目前国内外少见报道。银杏叶提取物(Extract of Ginkgo bilobo, EGb)是从银杏科植物叶子中经多步骤分离、纯化获得的一种混合物，成份复杂，其主要有效成份为黄酮糖类和烯内酯类。已知前者具有清除氧自由基功能，而后者中的内酯B是血小板活化因子受体的专一拮抗剂。日前国内、外都有EGb的药剂，主要用于防治心血管系统疾病。最近国内、外也用于治疗老年性痴呆症(Alzheimer’s disease,AD)等神经退行性疾病，并取得一定的疗效。银杏内酯B能否促进神经-干细胞分化为神经元，在国内外未见正式文献报导，更未研究银杏内酯B的这种作用是否有量效关系。本发明的目的是克服现有研究方法上的不足，设计一种应用银杏内酯B促进体内外肌肉间充质干细胞分化为神经元的方法，为临床促进受损伤的中枢神经结构和功能修复和药物新应用提供指导。本发明的基本方案包括:(1)将银杏内酯B直接作用体外培养的肌肉间充质干细胞，使肌肉间充质干细胞分化为神经元和星形胶质细胞。(2)研究以不同浓度的银杏内酯B直接作用体外培养的肌肉间充质干细胞，在不同时间观察肌肉间充质干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况。(3)进一步，将不同浓度的银杏内酯B注射到动物体内，观察银杏内酯B是否能诱导肌肉间充质干细胞增殖及分化为神经元和神经胶质细胞，从而更好地促进受损伤的中枢神经结构和功能修复。所述的银杏内酯B是血小板活化因子受体的专一拮抗剂，能促进培养的肌肉间充质干细胞分化为神经元。肌肉间充质干细胞是指肌肉组织中相对未分化的、具有增殖和分化潜能的细胞，可从发育中甚至成体内分离出来。
发明内容
(1)将银杏内酯B直接作用体外培养的肌肉间充质干细胞，使其分化为神经无和星形胶质细胞。(2)研究以不同浓度的银杏内酯B直接作用体外培养的肌肉间充质干细胞，在不同时间观察其分化为神经元和星形胶质细胞的情况。(3)进一步，将不同浓度的银杏内酯B注射到动物体内，观察银杏内酯B是否能诱导中枢神经本身的神经干细胞增殖及分化为神经元和神经胶质细胞，替换受损伤的细胞或死亡的细胞，从而更好地促进受损伤的中枢神经结构和功能修复。所述的银杏内酯B是血小板活化因子受体的专一拮抗剂，能促进培养的神经干细胞分化为神经无。肌肉间充质干细胞是指相对未分化的、具有增殖和分化潜能的细胞，可从发育中甚至成年的肌肉中分离出来。我们是从新生SD乳鼠的骨骼肌肉获取肌肉间充质干细胞。
附图1.肌肉 间充质干细胞分化A肌肉间充质干细胞对照组；B肌肉间充质干细胞分化为肌细胞；C肌肉间充质干细胞分化为神经胶质细胞
具体实施例方式体外培养肌肉间充质干细胞及其分化的细胞的制各方法如下:选用新生的SD大鼠，断头后取腿肌，剪碎后制成分离细胞悬液，分离细胞接种于细胞培养瓶/培养板中，放置于培养箱中培养。采取差速贴壁培养方式，3天后首次换液，10 14天后将原代培养所形成的肌肉间充质干细胞进行传代培养。第2代培养6 7天后，取部分细胞进行鉴定。收集第2代克隆的肌肉间充质干细胞，并接种在24孔培养板中。实验分成四组:对照组，20ug/ml银杏内酯B (上海永叶生物科技有限公司，90164)组，40ug/ml银杏内酯B组和60ug/ml银杏内酯B组。于体外分别培养7d和14d后，用免疫细胞化学方法检测神经元的特异性标记物、生长相关蛋白、星形胶质细胞特异性标记物和少突胶质细胞特异性标记物的表达，并计数分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的百分率。本发明详细的具体操作技术说明如下:1.体外分离肌肉间充质干细胞(1)在无菌条件下取出SD大鼠的大腿骨骼肌肉，放入70%酒精中消毒；(2)用剪刀去掉脂肪和肌腱，用剪刀将肌肉块剪成lmm3的小块，加入Iml胰酶，制成细胞悬液后置入离心管中；(3)37°C下，消化30min,再1200rpm离心5min,倒去上清液；(4)加入DMEM-F12 (Gibco公司，11330032)的培养液，用吸管吹打成单细胞悬液，移入培养瓶中培养，隔3d首次半量置换培养基；(5)培养10 14天后进行传代。2、肌肉间充质干细胞分化为肌细胞(1)将培养的第3-5代肌肉间充质干细胞收集，以2X 105/cm2的细胞密度接种于两块24孔培养板各孔中的盖玻片上；(2)每块培养板分对照、肌细胞分化实验组。(3)对照组培养液用DMEM-F12，另加10%胎牛血清配制。实验组培养基组成为对照组培养+加入2%马血清；(4)将培养板置饱和湿度、5% C02培养箱37°C培养。每隔3d半量置换培养液，培养7d终止。3、银杏内酯B对肌肉间充质干细胞的诱导分化(1)将培养的第3-5代肌肉间充质干细胞收集，以2X 105/cm2的细胞密度接种于两块24孔培养板各孔中的盖玻片上；(2)每块培养板分对照组、20ug/ml (培养液)银杏内酯B组、40ug/ml (培养液)银杏内酯B组和60ug/ml (培养液)银杏内酯B组，每组6孔；(3)对照组培养液用DMEM-F12，另加10%胎牛血清配制。银杏内酯B组的培养液是在对照组培养液中加入了银杏内酯B，浓度分别为20ug/ml，40ug/ml和60ug/ml ；(4)将培养板置饱和湿度、5% C02培养箱37°C培养。每隔3d半量置换培养液，培养7d和14d终止。
权利要求
1.一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法，其特征是:将银杏内酯B作用培养的肌肉间充质干细胞，诱导其分化为神经元和星形胶质细胞；应用银杏内酯B作用肌肉间充质干细胞，诱导其分化为神经元和星形胶质细胞。
2.根据权利要求1所述的药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法，其特征是:在体外培养应用的银杏内酯B浓度为20-60 μ g/ml。
3.根据权利要求1所述的药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法，其特征是:肌肉间充质干细胞的制各方法为:选用肌肉组织l_2g，剪碎后，经胰蛋白酶消化后制成分离细胞悬液，在基础培养基DMEM-F12和20%胎牛血清的混合培养液条件下进行培养，培养液中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，采取悬浮培养方式放置于37°C，5%C02培养箱中进行培养；7-10d后将原代培养所形成的肌肉间充质干细胞克隆用胰蛋白酶和EDTA混合液消化分离，进行传代培养；细胞培养过程每隔3天半保留换液I次。
4.根据权利要求1所述的药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法，其特征是: 该方法包括如下步骤: 将培养的第二代肌肉间充质干细胞收集，以2X 105/cm2的细胞密度接种于24培养孔板中； 每块培养板分对照组、20ug/ml (培养液)银杏内酯B组、40 μ g/ml (培养液)银杏内酯B组和60 μ g/ml (培养液)银杏内酯B组，每组6孔；对照组培养液用DMEM-Fl2，另加10%胎牛血清配制。
银杏内酯B组的培养液是在对照组培养液中加入了银杏内酯B，浓度分别为20ug/ml，40 μ g/ml和60 μ g/ml ; 将培养板置饱和湿度、5% C02培养箱37°C培养；每隔3d半量置换培养液，培养7d和14d终止。
5.药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法的应用，其特征是:在体内应用银杏内酯B作用肌肉间充质干细胞，诱导其增殖和分化为神经元和星形胶质细胞。
全文摘要
本发明涉及一种药物诱导肌肉间充质干细胞增殖和分化的方法。将银杏内酯B作用体外的肌肉间充质干细胞，诱导其分化为神经元细胞和星形胶质细胞。本发明在细胞水平上验证银杏内酯B可诱导肌肉间充质细胞向神经细胞分化，在参与神经网络的重建，修复中枢神经的功能有重要作用。
文档编号C12N5/079GK103087983SQ20111033095
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司