专利名称：Rna干扰沉默水稻黑条矮缩病毒多个基因的载体构建方法
技术领域：
本发明提供了水稻黑条矮缩病毒多基因干扰的构建方法，属于分子遗传学领域， 专用于水稻抗黑条矮缩病的转基因育种。
背景技术：
水稻黑条矮缩病(Rice black-streaked dwaf disease)是一种以灰飞虱为主要介体进行传播的病毒病，主要侵染禾谷类作物和禾本科杂草。病株症状为浓绿矮缩，叶片僵直，不抽穗或穗小。叶背的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起，该突起在发病初期呈腊白色，后变为黑褐色。发病田块一般减产10%-40%，重病田甚至颗粒无收。该病曾于20世纪60 年代中期在我国华东诸省市不少地区广泛发生，此后年发病面积逐年下降，但近年来，随着灰飞虱的大爆发，该病又迅速回升流行，近年来江苏部分地区危害严重。已有研究证实水稻黑条矮缩病病原是水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwaf virus, RBSDV)。该病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)， 全基因组测序工作已经完成，总长^141bp，基因组由10条双链RNA组成，按分子量大小命名为Sl-SlO ；RNA依赖的RNA聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等重要功能基因已经明确。该病的流行病学研究表明，水稻黑条矮缩病毒不能由卵传递到下一代，RBSDV必须由灰飞虱在带毒的寄主植物食毒后才能带毒和传播病毒。由于江淮流域近几年灰飞虱虫量基数大，而田间杂草，禾本科作物，如玉米是RBSDV的寄主，因此通过灰飞虱的食毒和传毒， 该病可能在江淮流域水稻生产区大发生。抗病育种是防治水稻黑条矮缩病的有效手段，而抗病资源是开展水稻抗病育种的前提。目前水稻黑条矮缩病的接种鉴定技术体系还未完全建立，抗病资源鉴定工作才起步， 主要依靠田间自然诱发鉴定，抗病育种尚属空白。因此筛选新的水稻黑条矮缩病抗病资源和借助基因工程手段创造抗水稻黑条矮缩病的新资源对于防治RBSDV具有重要意义。RNA干扰不仅是生物基因表达调控的一种基本机制，同时RNA干扰也是动植物抗病毒的一种防卫机制。将病毒的某一序列设计成可转录为双链RNA结构导入植物体使之表达，可诱发RNA沉默，使植物通过RNA沉默病毒基因获得抗病毒能力。但一些研究也发现 RNA沉默抗病效率不高甚至根本达不到抗病效果的现象。已有研究都主要是针对单链正义的RNA病毒基因组序列为靶位点来设计siRNA，， 选择的基因主要是复制酶基因、外壳蛋白基因。沉默抑制子基因发现后，发现干扰沉默抑制子基因较其它基因的效果更好。利用miRNA方法在同一载体中设计针对多个基因的靶位点干涉的途径对艾滋病毒具有很好的抑制效果。目前还没有利用RNA沉默机制来研究双链 RNA病毒的抗病性的研究报道。本发明利用利用重叠PCR将多个病毒基因编码片段连接，构建发夹结构，针对基因组复杂的双链RNA病毒RBSDV进行基因沉默，并以多个病毒基因为靶位点进行沉默，以期获得多基因沉默抗水稻黑条矮缩病的新资源，提高抗病效率。
发明内容
技术问题本发明的目的是利用重叠PCR将多个病毒基因编码片段连接，构建发夹结构，针对基因组复杂的双链RNA病毒RBSDV进行基因沉默，并以多个病毒基因为靶位点进行沉默， 主要用于水稻黑条矮缩病的转基因高效分子育种。技术方案水稻黑条矮缩病多基因沉默RNA干扰载体构建方法，其特征在于用于克隆水稻黑条矮缩病毒4个基因片段和重叠PCR的引物片段Si，RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)Sl-For :5，GGTGGAACGAAAGTTCAGTAGATC 3，Sl-Rev :5’ GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAGAATTTGGACTACACTTGGACGAA 3，片段S2，核心蛋白基因(CPl)S2-For 5，CTGACAACTTTTTGCCTGAAGCACCAGAGCGACAAGAAGAATCGAAA3，S2~Rev :5’ TGGGATCAGACGAAAATATTGGACGCAAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG 3，片段S6，沉默抑制子基因(SS)S6~For 5 CGTCCAATATTTTCGTCTGATCCCACTCGAATCATCCGTCACTTCTGAGT 3，S6-Rev 5' TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAAGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'片段S10，外壳蛋白基因(CP2)SlO-For 5' TTCATGGTAATGGTCAACAAACGCAGGAAACATTACTTTGAAGCCC 3'SlO-Rev :5’ CCACCATAATGTGTAACATCCGTA 3’其中，在下游引物Sl-Rev和上游引物S2-For的5 ‘端加相同的片段 GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAG，用于进行重叠PCR，将片段Sl和S2连接；同理，在下游引物 S2-Rev和上游引物S6—For的5'端加相同的片段TGGGATCAGACGAAAATATTGGACG用于进行重叠PCR，将片段S2和S6连接；在下游引物S6-Rev和上游引物SlO-For的5'端加相同的片段TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAA，用于进行重叠PCR，将片段S6和SlO连接。扩增水稻黑条矮缩病毒的cDNA，可以获得S1、S2、S6和和SlO共4个片段，大小分别为235bp,340bp,317bp,277bp ；然后利用引物Sl-For和引物S2-Rev,以片段Sl和片段 S2为模板进行PCR，将片段Sl和片段S2连接，获得605bp片段；利用引物S6-For和引物 SlO-Rev,以片段S6-For和SlO-Rev为模板进行PCR，将S6和SlO连接，获得574bp片段； 最后以引物Sl-For和引物SlO-Rev，以605bp片段和574bp为模板进行PCR获得1179bp片段。利用该病毒多基因融合片段可以用于后续的RNA干扰载体构建。有益效果本研究所提供的水稻黑条矮缩病多基因干扰构建方法，具有如下优点通过本发明获得了可对水稻黑条矮缩病毒多个基因进行干扰的RNA干扰表达载体构建方法。
图1水稻黑条矮缩病毒S1、S2、S6、S10片段PCR扩增产物在的琼脂糖胶电泳结果；(M 为 DNA ladder, a 为 lOObp，b 为 300bp, c 为 500bp, d 为 700bp, e 为 11Λ，f 为 1. 5kb, g 为 2kb ；1、2、3、4 为 RBSDV S1、S2、S3、S4 的 RT-PCR 产物)图2S1与S2，S6与SlO融合的PCR产物在1 %的琼脂糖胶电泳结果(M为 DNAladder, a 为 lOObp，b 为 300bp，c 为 500bp，d 为 700bp，e 为 1. Okb, f 为 1. 5kb, g 为 2. Okb ； 1是S6与SlO重叠PCR产物，2是Sl与S2重叠PCR产物)图3S1、S2、S6与SlO重叠PCR产物在的琼脂糖胶电泳结果。(M为DNA ladder, a 为 lOObp，b 为 300bp，c 为 500bp，d 为 700bp，e 为 1. Okb, f 为 1. 5kb, g 为 2. 01Λ ;1 为 4 个片段重叠PCR产物)
具体实施例方式下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。(一 )水稻黑条矮缩病多基因融合片段的构建方法1、RBSDV 总 RNA 提取和 cDNA 合成所用的玻璃、瓷器、铁器均采用干热(180°C )灭菌4h以上；配试剂等均用0. 1% DEPC处理水。实验步骤如下50_100mg感染水稻黑条矮缩病的水稻叶片组织加入液氮充分研磨，待样品冻融之前加Iml Trizol，样品体积不能超过Trizol的10%，继续研磨直至完全溶解，吸入离心管， 1200g离心IOmin (40C )，取上清，15-30°C 5min ；加0. 2ml氯仿(19 1的氯仿异戊醇) 溶液，用力摇15s，15-30°C 2-3min,2-8°C< 1200g离心15min，上层液相约为总体积的60% ； 取上清，加0. 5ml异丙醇，混勻，15-300C 10min，2_8°C< 1200g离心IOmin ；去上清，加75% 乙醇Iml (0. DEPC水配制)，振荡，2-8°C< 7500g 5min ；去乙醇，空气干燥，用0. 1 % DEPC 处理的水溶解，于_70°C冷冻保存。按下列反应体系和条件进行反转录反应逆转录反应体系(25μ 1)为先将总 RNA 1 μ 1 (2 μ g), Oligo dT (15)引物 2. 5 μ 1 和纯水混合，70°C变性5min后，迅速冰上冷却；然后再依次添加其它成分。包括5Xbuffer 2· 5μ 1，dNTP(10mmol/L)2. 5μ 1，RNasin 0. 5μ 1，逆转录酶(AMV) 1 μ 1，纯水 12. 5 μ 1。 42 °C，Ih ;95°C，加热5min终止反应。2、RBSDV多个基因部分编码区的克隆、测序以及重叠PCR连接根据已测序的RBSDV的基因组序列设计引物。分别设计合成RBSDV的RNA依赖的 RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRP)、核心蛋白(Core protein)、沉默抑制基因(Putative silencing suppressor)、外壳蛋白(Coat protein)编码基因的 4对引物。 用于本研究RT-PCR的黑条矮缩病病毒的4个片段所在基因组位置及片段大小见下表1 (详情请登陆:http://www. iah. bbsrc. ac. uk/dsRNA virus proteins/Fiji virus, htm)。在设计好的下游引物和另一对引物的上游引物添加相同的20个碱基，通过重叠PCR可以分别将 Sl和S2，S2和S6，S6和SlO连接，最后将S1，S2，S6和SlO连接成一个片段，送公司测序确认。用于克隆4个基因片段和重叠PCR的引物RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RdRp)Sl-For :5，GGTGGAACGAAAGTTCAGTAGATC 3，
5
Sl-Rev :5，GGTGCTTCAGGCAAAAAGTTGTCAGAATTTGGACTACACTTGGACGAA 3，核心蛋白基因(CPl)S2-For 5' CTGACAACTTTTTGCCTGAAGCACCAGAGCGACAAGAAGAATCGAAA3>S2-Rev :5’ TGGGATCAGACGAAAATATTGGACGCAAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG 3，沉默抑制子(SS)S6-For :5，CGTCCAATATTTTCGTCTGATCCCACTCGAATCATCCGTCACTTCTGAGT 3'S6-Rev 5' TGCGTTTGTTGACCATTACCATGAAGGACAAAACCTTTCCAATTATCGAG 3'外壳蛋白(CP2)SlO-For 5' TTCATGGTAATGGTCAACAAACGCAGGAAACATTACTTTGAAGCCC 3'SlO-Rev :5’ CCACCATAATGTGTAACATCCGTA 3’表1用于构建干扰RBSDV的RNA依赖的RNA聚合酶基因(Si)、核心蛋白基因(S2)、 沉默抑制子基因(S6)和外壳蛋白基因(SlO)所在基因组信息
权利要求
1.RNA干扰沉默水稻黑条矮缩病毒多个基因的载体构建方法，其特征在于利用重叠 PCR方法将黑条矮缩病毒的多个基因的编码片段融合为一个片段，构建成方向重复的RNA 干扰载体，对病毒多个基因进行干扰，以达到抗病目的。
全文摘要
本发明涉及水稻抗黑条矮缩病的多基因沉默RNA干扰载体构建方法，属于分子遗传学领域。用重叠PCR方法将水稻黑条矮缩病毒编码基因融合成一个片段，在片段连段再加酶切位点，分别连接到内含子前和后，利用过量表达启动子构建成干扰多个病毒基因的干扰载体。
文档编号C12N15/66GK102443602SQ20111033130
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者仲维功, 朱金燕, 杨杰, 王军, 范方军 申请人:江苏省农业科学院