一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物和现在农业高新技术领域，涉及一种水稻黑条矮缩病抗性的分子 鉴定方法，具体地说，涉及一种鉴定周期短、准确度高的水稻黑条矮缩病品种抗性的分子鉴 定方法。
【背景技术】
[0002] 水稻黑条矮缩病毒（Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)引起的水稻黑条 矮缩病是一种由灰飞虱striate/A/sFallen)传播的虫媒病毒病害，广泛分 布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚地区。水稻黑条矮缩病症状主要表现为植株矮缩，叶色 浓绿，分蘖增加，叶片短缩、僵硬，叶片背面、叶鞘以及茎杆表面有蜡白色脉肿出现，发病后 期变为沿叶脉纵向黑褐色的瘤状突起，穗小或不抽穗以及结实不良等症状，不同的品种、不 同的部位及生育期发病的症状也会有所不同。该病害1941年在日本有一次暴发，之后于20 世纪60年代在中国、日本、韩国、朝鲜均成为流行病害，此后30年间一度销声匿迹，20世纪 90年代后期水稻黑条矮缩病在江浙沪以及安徽福建北部在内的长江中下游稻区暴发流行， 造成了巨大的经济损失。
[0003] 水稻黑条矮缩病主要以灰飞虱为传毒媒介进行持久性传播，介体飞虱一旦染毒， 终身带毒，并能连续传毒，但不经卵传毒。病毒主要在大麦、小麦病株上越冬，有部分也在灰 飞虱体内越冬。田间病毒通过麦、早稻、晚稻的途径完成侵染循环。第一代灰飞虱在病麦上 接毒后传到早稻、单季稻、晚稻和青玉米上传毒。稻田中繁殖的2、3代灰飞虱，在水稻病株 上吸毒后，迀入晚稻和秋玉米上传毒，晚稻上繁殖的灰飞虱成虫和越冬代若虫又进行传毒， 传给大麦、小麦。灰飞虱在病毒寄主上吸汁获毒，最短获毒时间30分钟，1-2天即可充分获 毒，病毒在灰飞虱体内循回期为8-35天，接毒时间仅1分钟，获毒最低温度在8°C以下，4~ 5°C介体不能传毒。
[0004] 近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、农田生态多样、冬季气候变暖和感病品 种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、湖南等省大规模发生，迅速成为华东稻区 最主要的水稻病害之一，造成了粮食减产、农民减收，给水稻生产造成严重损失，同时也严 重挫伤了农民的种粮积极性，也对全国的粮食安全构成了极大的威胁。
[0005] 与大部分植物病毒病流行一样，水稻黑条矮缩病的流行同样需要其流行生态系统 中病毒-介体-寄主-环境4大基本因子的完美结合。现今对该病害的突发成灾原因还未 有详细的研宄，对灰飞虱种群数量以及带毒率波动、暖冬、品种、栽培模式等条件如何对病 害流行起作用和为什么起作用还有待进一步研宄。利用水稻品种本身抗病性是防治水稻黑 条矮缩病的有效手段，由于现在缺乏高抗品种，挖掘、筛选较好抗病性的种质资源对该病害 的控制有着重要的意义。
[0006] 目前水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定主要有田间自然鉴定法和室内人工接种鉴 定法。田间自然发病鉴定将待鉴定水稻以小区种植于大田，传毒介体灰飞虱自然传毒，待水 稻显现病症后调查各鉴定水稻小区的穴发病率来鉴别水稻的抗性水平。田间自然鉴定法 无法排除排趋性的干扰，可能带来假抗病表现。室内人工接种鉴定是在人工控制条件下定 量接种带毒灰飞虱一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度来评价 待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平，该方法可以克服自然鉴定法中排趋性的干扰，实 现了科学准确的水稻抗病的评价，然而该方法用于品种抗性鉴定需要大量的传毒介体灰飞 虱，人工筛选无毒灰飞虱人工饲养规模量小，难以满足品种抗性鉴定的规模量的需求，限制 了该方法的推广应用。同时，无论是田间自然鉴定法和室内人工接种鉴定法，均需要培养至 水稻分蘖盛期显症后通过调查发病率来评价品种抗性水平，鉴定周期很长，为保证准确度 需要大量的实验处理，费时又费力。
[0007] 当前检验鉴定植物病毒的技术飞速发展，除了传统的生物学方法、血清学方法、电 子显微镜法、芯片检测法，新兴起的分子生物学方法给植物病毒的鉴定提供了新思路。目前 主要应用的定性检测分子生物学方法包括病毒核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术和多聚 酶链式反应（PCR)技术，定量检测主要是指实时荧光定量PCR技术。此种方法灵敏度高，特 异性强，检测速度快，操作过程也比较简便、可用于大量样品检测。荧光定量PCR在植物病 毒检测与鉴定方面，能够定量检测病毒拷贝数。应用荧光定量PCR检测未知样本时，相比其 他定量方法和普通PCR方法特异性更强、准确性高、灵敏度高、线性关系广、操作简单安全， 样品的污染较底，且不需要后期处理。
[0008] 我们研宄证明对水稻植株接种RBSDV，不管是抗病还是感病水稻植株体内，均检测 到RBSDV病毒，另外水稻植株苗期感染RBSDV病毒之后，症状不凸显，不能确定其抗病性，需 要等到分蘖盛期才能确定其抗病性。令人振奋的是，我们新近研宄发现水稻低氧萌发所产 生的胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直 接相关。胚芽鞘是水稻胚芽外的锥形套状物，是一个鞘状结构，胚芽鞘本来是植物叶片的保 护组织，有保护胚芽中更幼小的叶和生长锥的作用。通常水稻植株感染RBSDV病毒都是在 水稻秧苗期通过灰飞虱传毒的，而种子萌发产生胚芽鞘的传毒研宄被忽略，我们研宄发现 胚芽鞘接种RBSDV病毒后一段时间胚芽鞘内的RBSDV病毒增殖速度与水稻品种抗性直接相 关，我们的研宄发现给水稻黑条矮缩病抗病性的鉴定提供了新思路。
[0009] 本发明通过胚芽鞘培养前期激素的低氧诱导和胚芽鞘培养后期激素的抑制培养 来拓展胚芽鞘的生长时间，而在此时间内通过荧光定量RT-PCR技术对接种病毒后胚芽鞘 内的RBSDV含量进行检测，通过制作RBSDV增殖趋势图实现了接毒后胚芽鞘内RBSDV病毒 增殖速度快速而准确地测量，进而通过比较待鉴定水稻和鉴定标尺胚芽鞘内病毒粒子增殖 速度差异快速鉴定水稻品种对黑条矮缩病的抗性水平和抗性等级。这一鉴定方法除了可以 应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育外，亦可以应用于抗病基因 定位的表型鉴定和抗性遗传规律研宄等众多领域。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是针对现有的水稻黑条矮缩病品种抗性鉴定方法存在有鉴定周期 长、准确度低等缺点，提供了一种鉴定周期短、准确度高的水稻黑条矮缩病品种抗性的分子 鉴定方法。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案解决的： 一种水稻黑条矮缩病抗性的分子鉴定方法，其特征在于：该鉴定方法包括以下步骤： 1) 获取带毒灰飞虱和鉴定标尺：大田采集灰飞虱高龄若虫并纯化筛选，传代保存，鉴定 前采用RBSDV毒源饲毒1. 5-2. 5龄期灰飞虱若虫，获得带毒灰飞虱；根据人工接毒鉴定中不 同品种对水稻黑条矮缩病抗性表现设置高抗、中抗、感病三个鉴定标尺，选择三个相应水稻 品种做为鉴定标尺； 2) 带毒灰飞虱定量传毒胚芽鞘：每个品种取15-20粒种子，用0.6%次氯酸钠溶液浸泡 15min进行灭菌，超纯水冲洗干净，然后放置于25°C条件下适宜浓度的IAA溶液中低氧浸种 培养3天，诱导出胚芽鞘；将胚芽鞘用超纯水洗净，放入铺有吸水棉的试管中，每个试管一 个种子，定量接种带毒灰飞虱，用透气纱布封闭试管后平置，传毒24h;传毒后胚芽鞘用超 纯水冲洗，然后放置于25°C条件下浸润了适宜浓度的ABA溶液的吸水棉上暗培养； 3) 荧光定量PCR获得每个品种周期时间点的RQ值：按照周期时间点取材上一步骤的 胚芽鞘的特定部位，取材2-3重复，提取并纯化病毒RNA，荧光定量PCR扩增RBSDV病毒S7 片段，扩增完毕，进入结果分析界面，以你挪05为内参，与对照组相比，获得每个品种每个 取样时间点重复的RBSDV病毒S7与内参基因的相对表达量（RQ值）； 4) 绘制RBSDV增殖指数趋势线并进行抗性评价：用多重复的RQ值统计每个待测品种 和鉴定标尺饲毒后每个取样时间点的RQ值均值，然后以RQ值均值为纵坐标，周期取样时间 点为横坐标，对数据进行统计分析，获得RBSDV增殖指数趋势线y=Aek