UBC和Actin1作为水稻黑条矮缩病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明运用geNorm和NormFinder软件鉴定了感水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)植株中焚光定量PCR的内参基因组合，UBC和Actinl 作为RBSDV侵染植株中基因功能分析的双内参基因，明显优于单个内参基因的校正效果， 可应用于RBSDV侵染植株基因功能研宄，属于分子生物学领域。
【背景技术】：
[0002] 水稻黑条矮缩病，病原为水稻黑条矮缩病毒，是一种由灰飞虱以持久性不经卵方 式传播的恶性病毒病。感染RBSDV水稻病株大都不能抽穗，减产严重，除水稻外，还危害小 麦、玉米、大麦及高粱等作物。20世纪60、90年代后期该病害在华北、华东等地暴发成灾，近 年来，感病品种的广泛种植及稻麦轮作方式的推广和冬季气候变暖等环境条件的变化使传 毒介体灰飞虱的发生量不断上升，导致该病害在华东稻区大面积发生。迄今为止，几乎没有 能有效防治病毒病的化学药剂，治虫防病的应急措施无法作为一项长期策略，而研宄寄主 在病毒侵染后基因的功能进而病害防控中加以利用则是一种更为环保的手段。要获得准确 和可靠的基因表达结果首先需要有用于数据校正的内参基因，也有利于不同研宄间数据的 借鉴与比较。用于校正和标准化的内参基因必需在任何条件下是持续且稳定的表达，否则 就会导致错误的结果，现有的研宄多以THMl-Like等单个基因作为内参基因，其在不同处 理时可能会有稳定性问题，有必要尽快确立一种合适的内参基因体系以解决这一问题。
【发明内容】
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[0003] 本发明针对上述研宄背景，以接种水稻黑条矮缩病毒的日本晴水稻为材料对常用 的内参基因进行分析，发现UBC和Actinl是表达最稳定的基因，以这两个基因作为RBSDV 侵染后水稻中基因功能分析的内参基因组合，明显优于单个内参基因的校正效果。
[0004] 本发明所提供的水稻黑条矮缩病毒侵染植株中基因功能分析的双内参基因组合， 是通过以下方法获得的：
[0005] 1)用荧光定量PCR的方法，对接种水稻黑条矮缩病毒的日本晴水稻以14对水稻中 常用内参基因的表达及其相关引物的特异性进行评估；
[0006] 2)运用geNorm程序评估候选内参基因表达的稳定性；
[0007] 3)通过NormFinder软件验证geNorm程序的运算结果；
[0008] 4)依据geNorm程序可以计算引入一个新内参基因后标准化因子的配对差异V值， 其默认阈值为0.15。根据Vn/n+Ι比值可以判断引入一个新内参基因是否会对标准化因子 产生显著影响，如果Vn/n+Ι大于0. 15,则需要再引入第n+1个内参基因；如果Vn/n+Ι小于 0. 15,则不必再引入新的内参基因；
[0009] 5) RBSDV侵染条件下荧光定量PCR多内参和单内参校正的数据分析比较，验证多 内参基因的组合是否优于单内参基因。
[0010] 在RBSDV侵染的条件下鉴定的用于校正荧光定量PCR最合适的内参基因 UBC和 Actinl的应用范围包括：RBSDV侵染植物中病毒的定量；RBSDV侵染植株中相关基因的表达 分析以及RBSDV侵染植株模式的研宄。
[0011] 本发明能为在RBSDV侵染植株中获得准确和可靠的基因表达结果提供理论依据， 其结果可以用于研宄RBSDV侵染植株基因功能。
【附图说明】：
[0012] 图1荧光定量PCR扩增的特异性分析。㈧候选内参基因的溶解曲线图，实验有三 次生物学重复，溶解曲线呈单峰；(B)2%琼脂糖凝胶电泳检测候选内参基因扩增的特性条 带；(C) 2%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量；
[0013] 图2候选内参基因的表达水平分析。㈧14个候选内参基因的平均Ct值；(B)比 较RBSDV侵染植株与对照（不侵染）植株中14个候选内参基因的表达水平，注：Ct values : Ct值；
[0014] 图3RBSDV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的geNorm分析，注：Average expression stability values (M):内参基因表达稳定性平均值（M)，pairwise variation (V):配对差异值（V);
[0015] 图4RBSDV侵染条件下荧光定量PCR内参基因的NormFinder分析，注：Average expression stability values (M):内参基因表达稳定性平均值（M);
[0016] 图5RBSDV侵染条件下OsPRlb和OsWRKY基因表达在多内参或单内参条件下的数 据分析比较，注：Relative expression levels:相对表达水平。
【具体实施方式】：
[0017] 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0018] 实施例1，RBSDV侵染植株中基因功能分析内参基因组合的获得
[0019] 1、植物材料、病毒分析以及侵染方法
[0020] 水稻种子（日本晴）首先用0. 1% HgC12消毒1小时；然后用去离子水冲洗干净， 25°C浸种一天，催芽一天；催芽后的种子用木村B培养液中培养，光照14小时，黑暗10小 时，温度28±1°C。
[0021] 于江苏盐城、徐州、连云港等水稻黑条矮缩病重病区采集表现RBSDV症状（浙江农 业科学，1984,（4) :185-192.)的水稻病株，通过RT-PCR方法（江苏农业学报，2009, 25(6): 1263-1267)检测病株是否携带RBSDV，利用水稻条纹叶枯病毒（RSV)外壳蛋白基因对应的 引物（CP-F :ATGGGTACCAACAAGCC，CP-R :CTAGTCATCTGCACCTT)检测病株，选取不携带 RSV 的 RBSDV病株作为毒源。将1-2龄无毒灰飞虱若虫在毒源上饲毒2-3d，而后移入育有武育粳3 号秧苗的烧杯中饲养使其度过循回期，12-13d后从每杯中随机取出30头经DIBA方法（南 京农业大学硕士论文，2012,杜琳琳）测定其带毒率，用于测算有效接种虫量[有效接种虫 量（虫）=接种虫量（虫）X带毒率（％ )]。
[0022] 14天大小的幼苗每棵接种10头有病毒的灰飞虱；接毒3天后，移除灰飞虱，将 幼苗移栽到大田中；取接病毒后7、14、21天的水稻叶片保存在-80°C冰箱中做后续研宄 (RT-PCR方法确认侵染是否成功）。
[0023] 2、RNA 提取
[0024] 总RNA按照说明书用Trizol提取，并用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度和质 量。只有260/280的比值在1. 9和2. 1之间且260/230的比值大于2. 0的RNA可以用作后 续的实验。RNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测，所有的样品都标准化到同一浓度，用于后 续的实验。
[0025] 3、反转录和荧光