检测pdgfra基因d842v多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法

检测pdgfra基因d842v多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测roGFRA基因D842V多 态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于TOGFRA基因D842V多态性位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] 血小板衍生生长因子（PDGF)是一种促血管生成因子，H)GF是多种间质细胞如成 纤维细胞、血管平滑肌细胞、肾小球血管细胞、神经胶质细胞、内皮细胞等的强效促有丝分 裂原和重要的血管生长因子，由血小板，组织细胞和某些肿瘤细胞产生。血小板衍生生长因 子受体（PDGFR)是一种受体酪氨酸蛋白激酶家族成员，能够促进细胞的趋化、分裂与增殖， 在机体生长发育、创伤修复等生理过程中起积极重要的作用，并与肿瘤的发生密切相关。 TOGFRA是TOGFR的一种，在促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管生成等方面发挥重要作用。 TOGFR通路的激活涉及关键的下游信号通路，包括RAS-MAPK途径和PI3K途径等。
[0003]TOGFRA基因由人类第4号染色体基因编码（4ql2)，TOGFRA基因全长约65kb，由 23个外显子组成，其中外显子3~10编码胞外的5个免疫球蛋白样区域，外显子11编码 跨膜区，外显子13~15和外显子17~21分别编码胞内的2个酪氨酸激酶区。TOGFRA基 因编码的蛋白质是血小板衍生生长因子受体a (platelet2derivedgrowthfactorrecep toralpha，TOGFRA)，TOGFRA为一种单链跨膜糖蛋白，由1089个氨基酸组成，593~954位 属于酪氨酸激酶区。
[0004] I^DGFRA基因突变常发生于12号外显子和18号外显子。伊马替尼（格列卫， Gleevec)作用于TOGFR下游的酪氨酸激酶，临床研宄显示伊马替尼用于治疗胃肠道间质 瘤、脑瘤和黑色素瘤效果显著，但TOGFRA基因外显子18的D842V突变会导致胃肠道间质瘤 患者对伊马替尼原发耐药。胃肠道间质瘤患者中约7%的病例携带TOGFR基因突变，其中 1/3病例有TOGFRA突变，突变主要发生在编码活性结构域的外显子18上，且TOFGR a基因 突变与C-KIT基因突变是相互独立的。选择靶向药物治疗癌症的患者应进行该基因的突变 检测，以帮助医生了解患者是否会对单抗类药物产生耐药性。
[0005] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0006]如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0007] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[MolDiagnTher. 2010Jun1; 14(3): 163-9，UnitedStatesPatent 20120135406]。
[0008] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0009] 4)PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[ClinChimACqa. 2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStates Patent20110045479]〇
[0010] 5)PCR-TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[JClinMicrobiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0011] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0012] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatlAcad SciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[JVirolMethods. 2008Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0013] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[ExpMolPathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80;UnitedStatesPatent20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修饰的碱基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0014] 国内广州益善生物技术有限公司申请的一种TOGFRA基因突变检测液相芯片（专 利号CN101984072A)，采用的液相芯片技术对TOGFRA基因的D842V突变情况进行检测。
[0015] 芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于 全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。而普通的荧光 定量PCR技术对最为关键的位点特异性引物设计，也仅按照引物设计的一般原则进行，没 有一个好特异引物的筛选客观指标，最为关键的是他们的结果判断，依然模糊，没有"全或 无"的概念，这样非特异性的缺点还是无法克服。双探针的荧光定量PCR方法，由于需要两 条探针，而且常常是Taqma