589, 250)，cycliC〇n(美国专 利号 6,383, 752)，MGBEclipseTM探针（EpochBiosciences)，发夹探针（美国专利号 6, 596, 490)，肽核酸（PNA)探针。检测探针可以包含焚光报告分子，例如，6-羧基焚光素 (6-FAM)或四氯荧光素（TET)，和淬灭分子部分，例如四甲基若丹明（TAMRA)，BlackHole QuencheRS(Biosearch)，IowaBlack(IDT)，QSY猝灭剂（MolecularProbes)和Dabsyl和 Dabcel磺酸盐/羧酸盐猝灭剂（Epoch)。
[0044] "共用特异性引物"是指在PCR反应中与等位基因特异性引物配对的引物，它能同 不同位点的等位基因特异性引物配对使用。
[0045] "热稳定性的聚合酶"是指对热稳定性的或热抗性的酶，主要指DNA聚合酶，该酶在 PCR扩增时，在升高的温度条件下不会发生失活。
[0046] 寡核苷酸的"Tm"或"熔解温度"是指一段DNA中50%的分子与互补序列杂交时 的温度。Tm值可以使用熟知的公式来计算（见，Maniatis，T.等人：Molecularcloning， ColdSpringHarbor,N.Y. ：1982)〇
[0047] "灵敏度"是指能够被检出模板的最小量（拷贝数）。
[0048] "特异性"是指区分匹配模板和错配模板的能力。特异性经常表示为ACt=Ct错 配-Ct匹配。
[0049] "选择性"是指AS-PCR测定可用于测定混合物中的少数（通常是突变）等位基因 而无来自多数（经常是野生型）等位基因的干扰的程度。选择性经常表示为比例或百分率。 例如，能够在存在100个野生型模板的情况下检出1个突变模板的测定被称作具有1 : 100 或1%的选择性。
[0050] "Ct"值是指循环阈值，代表PCR扩增曲线由基线变为指数增长拐点时的循环数。
[0051] "德尔塔Ct"或"Act"是指信号通过固定阈值时，两个不同样品或反应之间的循 环数差异。ACt是达到指数扩增时，两个不同样品或反应之间的循环数差异。ACt可用于 鉴定匹配引物与错配引物之间的特异性。
[0052] 本发明涉及快速检测TOGFRA基因D842V多态性位点的引物和试剂盒。具体地讲， 本发明是基于Past-PCR (Perfect allele-specific Taqman PCR)方法的基础上，成功应 用于TOGFRA基因D842V多态性位点检测。所谓Past-PCR是由检测基因多态性位点或突变 的高特异性AS-PCR方法和Taqman探针的焚光PCR技术结合而成，其仅用一条Taqman探 针，在多数的情况下，这条探针为常规的Taqman探针，仅在部分基因中因富含AT碱基的特 殊序列，采用Taqman-MGB或LNA等探针，除此之外无需任何额外的封闭探针或报告探针， Past-PCR方法将AS-PCR和Taqman荧光PCR两种方法完美结合，并使两者的优点得到了极 度的发挥，具体表现在AS-PCR方法中，在不增加任何成本的情况下，靠引物设计和独特的 验证方法成功消除了非特异性扩增，使得结果判断呈现出"全和无"方式，即有就有，没有就 没有，使得结果的判断简单而准确，这是对过去的AS-PCR方法最大的改进，也是对AS-PCR 方法为人所诟病的有效弥补，从而将AS-PCR方法的优点发挥到了极致，是该方法所能达到 的最高境界。众所周知，Taqman焚光PCR具有密闭性检测无需反应完结后的处理，不仅节 省了时间，而且减少了PCR产物污染的风险，探针的第二次识别靶序列保障了检测的特异 性和可靠性，还可用于对基因的定量检测，达到了临床使用标准等优点。Past-PCR方法具有 AS-PCR方法和Taqman荧光PCR方法的双重优点，并且是这两种方法结合在一起时，检测组 份所能达到的最简化构成，因此，我们将其称作为完美的等位基因特异性TaqmanPCR。
[0053] 基于Past-PCR方法，发明了用于检测基因TOGFRA基因D842V多态性位点的试剂 盒，其基本组成为：(a)高度特异的等位基因特异性引物；(b)荧光检测探针；（c)与等位基 因特异性引物配对的另一条特异性引物。
[0054] 其中，本发明提供的检测TOGFRA基因D842V多态性位点的引物，包括：野生型特异 性上游引物、突变型特异性上游引物和野生型特异性上游引物与突变型特异性上游引物共 用的下游引物； 且所述野生型特异性上游引物具有SEQNo. 17序列，所述突变型特异性上游引物具有SEQNo. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQNo. 16序列。
[0055] 同时还提供了含有上述引物的检测试剂和试剂盒，以解决以往检测TOGFRA基因 D842V多态性位点存在操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度 低，不能同时大规模检测临床标本等问题，实现了检测简单、快速、准确、廉价的理想要求， 为科研和临床基因型和基因突变分析提供了强有力的工具。
[0056]优选，所述试剂盒中还包括与所述引物配合使用的探针，其中，所述探针为Taqman探针，具有SEQNo. 15序列，整个试剂盒中仅使用一条探针，别无其他诸如封闭探针等，降低 试剂盒的成本。
[0057]进一步优选，所述试剂盒还包括PCR反应管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR缓冲液、 检测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物、检测管家基因GAPDH的 探针、阳性质控品和空白对照； 所述检测管家基因GAPDH的上游引物具有SEQNo. 19序列；所述检测管家基因GAPDH的下游引物具有SEQNo. 20序列；所述检测管家基因GAPDH的探针具有SEQNo. 21序列；其 中，将dNTPs和Taq酶混合，能够保障dNTPs的稳定性，使其可经受多次反复冻融的考验；检 测管家基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针是用于作为内参照，为防止检测时出现假 阴性；阳性质控品为AT型人基因组DNA;空白对照为灭菌超纯水。
[0058]进一步优选，所述突变型特异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述 检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基 因GAPDH的探针被预先包被于T型PCR反应管内；以及与所述野生型特异性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因 GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针被预先包被于A型PCR反应管内，按最 佳的反应用量预先包被在PCR反应管中，每一个反应管中实际包被六条寡核甘酸，即一条 针对等位基因的一种特异性上游引物、一条探针(通常为Taqman探针)、一条共用特异性下 游引物、一条检测管家基因GAPDH的上游引物、一条检测管家基因GAPDH的下游引物和一条 检测管家基因GAPDH的探针。这样为了检测一个位点不同的基因多态性，常需要分别包被 两管或两管以上的PCR反应管，它们中探针、共用特异性下游引物、检测管家基因GAPDH的 上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针是一样的，不同的 仅是鉴定等位基因不同型别的特异性上游引物，这样预先包被避免了操作者出现位点配错 的可能，而且节约了大量操作时间。
[0059]进一步优选，所述T型PCR反应管内突变型特异性上游引物、所述共用的下游 引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH的下游 引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、50nM-400nM、lpm_20pm、lpm_20pm、0. 05pm_5pm;以及所述A型PCR反应管内野生型特异性上游引物、 所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基 因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为50nM-2um、50nM-2uM、 50nM-400nM、lpm-20pm、lpm-20pm、0. 05pm-5pm。最优为，所述T型PCR反应管内突变型特 异性上游引物、所述共用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所 述检测管家基因GAPDH的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、 500nM、lOOnM、5pm、5pm、2. 5pm;以及所述A型PCR反应管内野生型特异性上游引物、所述共 用的下游引物、所述探针、所述检测管家基因GAPDH的上游引物、所述检测管家基因GAPDH 的下游引物和所述检测管家基因GAPDH的探针浓度分别为500nM、500nM、100nM、5pm、5pm、 2. 5pm〇
[0060] 由于在等位基因特异性引物内引入了错配的碱基，使其在反应时的效率下降，不 同的引物下降程度不同，通常要增加10至20个循环才能达到没有错配时的效果，保证检 测的灵敏度，优选PCR反应按两步扩增循环程序进行，且第一步扩增的循环数小于第二步 扩增的循环数，所述第一步扩增的退火温度高于第二步扩增的退火温度，第一步扩增使用 较高退火温度，第二步扩增使用