较低退火温度，目的是增加第一步扩增时引物退火时的特 异性，从而保证Past-PCR检测高度特异性的目的；具体而言优选所述PCR反应的条件为： 37°C2min，95°C2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，55°C~68°C退火 32s，循环 10~15次；第二步，95°C变性5s，50°C~65°C退火、延伸32s，循环30~50次，收集荧光信 号；更为优选PCR反应的条件为：37°C2min，95°C2min预变性；第一步扩增，95°C变性 5s，63°C退火32s，循环15次；第二步，95°C变性5s，60°C退火、延伸32s，循环40次，收 集荧光信号。
[0061] 具体的检测过程为： 1) 将待检测样品分别放入预先分别包被有野生型特异引物、共用的下游引物、探针、检 测管家基因GAPDH的上游引物、检测管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的 探针以及突变型特异引物、共用的下游引物、探针、检测管家基因GAPDH的上游引物、检测 管家基因GAPDH的下游引物和检测管家基因GAPDH的探针两组PCR反应管内，并加入PCR 缓冲液、dNTPs和Taq酶混合液、灭菌超纯水和基因组DNA，盖紧管盖，在荧光定量PCR仪上 进行反应，并收集荧光信号； 2) 如果检测样本仅有突变型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道 有对数增长的扩增曲线，可判定样本为T型，即突变型纯合子； 如果检测样本仅有野生型反应管在FAM通道有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有 对数增长的扩增曲线，可判定样本为A型，即野生型纯合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均有对数增长的扩增曲线，同时VIC通道有对数增长的扩增曲线，可判定样本为AT型，即杂合子； 如果检测样本突变型和野生型反应管在FAM通道均无对数增长的扩增曲线，可能样本 或操作存在问题，或者样本DNA浓度过低，应重新提取样本DNA进行试验。
[0062] 下面详述检测过程中各组份介绍： (一）等位基因特异性引物： 等位基因特异性引物的等位基因特异性核苷酸部分互补于基因的一个等位基因位点， 但不互补于该基因的另一个等位基因位点。通常而言，等位基因特异性引物的等位基因特 异性核苷酸部分位于等位基因特异性引物的3'端的末位碱基。在某些情况下，等位基因特 异性核苷酸部分也可位于等位基因特异性引物3'末端的其他碱基位置。
[0063] 在一些情况下，等位基因特异性引物除3'末端互补于等位基因位点有所变化外， 我们常常要在引物的其他位置引入错配的碱基，如在引物3'端倒数第二位或第三位引入碱 基错配，或第二和第三位的连续错配；针对不同的SNP或突变位点，在引物3'端倒数第二位 或第三位引入碱基错配的基础上，还可在引物的其它位点增加碱基错配来满足反应特异性 的要求，越远离3'端，增加错配的碱基数越多，在5'端可达最多。等位基因特异性引物的 长度主要依据其^值来决定，通常而言其Tm值比PCR循环的退火温度低大约5-20°C。
[0064] 两条检测对应基因多态性的等位基因特异性上游引物，除3'端检测的位点其碱基 不同外，其余序列尽可能相同，二条引物的Tm值也尽可能一致。
[0065]低1"的等位基因特异性引物（ASP)有更高的特异性。一般情况下，等位基因特异 性引物为短寡核苷酸，其长度是大约15-30,其Tm是大约40 °C至60 °C，比扩增过程中使用的 PCR循环条件的退火/延伸温度低大约5°C至20°C。
[0066]由于等位基因特异性引物的设计和筛选十分重要，好的引物需要从众多待选的 引物中选出，因此我们建立了一个筛选的方法，其等位基因特异性引物的具体筛选过程如 下： ⑴设计外围引物及PCR扩增：首先在待检基因突变点或SNP位点的上下游，设计一对PCR扩增引物，然后用该对引物，对目的基因进行常规的PCR反应，其中扩增片段长度可在 几十至数千碱基对，优选长度为200至500碱基对； ⑵克隆PCR产物：将扩增出的PCR产物，利用AT克隆的方法，重组到普通的T载体质粒 中，得到重组质粒，其中得到的重组质粒可以进行测序验证，从而确保PCR产物的正确性； ⑶构建重组突变体：根据生物信息学所提供的信息，采用分子克隆技术，将突变体的序 列，构建至上述得到的重组质粒中，将构建的重组突变体进行测序验证序列，从而确保其正 确性； ⑷设计及筛选突变位点特异性引物：设计两条等位基因特异性引物，一条引物的3'端 同突变序列互补，另一条引物的3'端同正常序列互补；然后分别用等位基因特异性引物和 对应的常规PCR共同下游引物配对，以上述构建好的重组突变体作为反应模板，利用荧光 定量PCR仪，对反应体系，进行筛选；其中，反应可采用荧光染料，如SYBRGREEN，也可采用 特异性的Taqman荧光探针，按照所加样品量为0. 1微克全基因组DNA的标准进行筛选，其 具体的筛选内容如下： (a) 设定PCR反应条件：首先设定PCR反应的退火温度完全一致，具体温度为55°C~ 68°C，PCR循环次数为40次，PCR反应的酶和缓冲体系均优化后固定不变，此反应条件的设 定是为了方便同时检测多种基因突变； (b) 特异性筛选：采用突变型的引物以野生型的重组质粒为模板，筛选出的引物其Ct 大于40 ; 其中循环阈值的确定原因如下，突变型引物在野生型模板发生非特异性扩增比野生型 引物在野生型模板发生特异性扩增多19个循环，按照临床实际检测时，所加样品量为0. 1 微克全基因组DNA的标准，我们通过下列公式，拷贝数=(DNA量ngX6. 022X 1023V(长度bpX 109X660)，其中全基因组DNA的长度为30亿对碱基，因此0. 1微克全基因组DNA的拷 贝数为：3. 09 X 104,反映在荧光定量PCR的Ct(定量循环阈值）大概为21，这样我们得到 第二个筛选指标，即用突变型的引物，在野生型的重组质粒为模板时，所得的Ct应该大于 40,方能保证检测不会出现假阳性，两者的扩增效率相差为40-21=19个循环，即扩增效率 相差19个循环以上，将成为我们判断等位基因特异性引物特异性好坏的客观指标。我们知 道当引物3'端与模板错配时，延伸效率将下降103-1066倍，换算成反应循环数则下降约13 至27个循环，这就是我们能筛选出理想引物的理论依据，因为不进行引物筛选，19-13=6个 循环，势必产生假阳性，该引物的特异性就不好，而19-27=-8,不可能产生假阳性，有8个循 环数的范围供我们对引物进行筛选。按照这一要求，我们设计一系列等位基因特异性引物， 从长短上、从靠近3'端人为引入碱基错配上着手，加上其配对的下游引物，利用构建好的野 生型和突变型重组质粒，分别进行荧光定量PCR反应的交叉筛选，即当用突变引物与野生 型的模板进行扩增时，与用野生型引物同野生型模板的反应要多用19个循环数以上，反之 亦然，那么这样的引物就具备高度的特异性。
[0067] (c)敏感性筛选：将筛选出的特异性引物用与重组突变型质粒作敏感性试验，将检 测灵敏度小于10-1000个拷贝的特异性引物筛选出来，即为所需的突变特异性引物。
[0068] 通过以上几方面的筛选，所得到的等位基因特异性引物将具备高度特异性和高度 敏感的理想引物。
[0069](二）检测探针： 在一些情况下，检测探针的^值大约为60°C至70°C，最佳为65°C，探针长度根据其Tm 值决定。尽管有多种不同形式的探针可供选择，Taqman探针（AppliedBiosystems，Foster City)常常是首选。在一些特殊的情况下，如检测序列中AT含量过高，可以采用提高!"值 的Taqman-MGB等类型的探针。
[0070] 共用的特异性引物，在一些情况下，共用的特异性引物的1"值大约为50°C至 70 °C，最佳为60 °C，其长度由其Tm值决定，一般在15-25碱基之间。
[0071](三）其他成分： 本发明使用的DNA聚合酶是Taq酶，及其突变体、衍生物或片段，也可是其他的耐热DNA聚合酶，在一些情况下，也可采用Hotstart Taq酶，以增加反应的特异和高效性。
[0072] 本发明中所提供的针对TOGFRA基因D842V多态性位点所提供的引物和试剂盒，主 要是针对等位基因特异性引物PCR扩增法的缺点，利用分子克隆技术，事先分别构建含待 检基因野生型和突变型的重组质粒，以此重组质粒为阳性模板，筛选确定特异地分别与3' 末端突变位点或野生位点碱基互补的两条特异引物，一旦筛选出的特异引物序列，将是我 们检测体系的关键元素。本发明的上述产品，可用于任何型号的荧光定量PCR仪，试剂成本 同如今市面上的荧光定量PCR试剂相当，因此较好地克服了其他采用等位基因特异性引物 PCR扩增法的不足。
[0073] 本发明的优点在于：所述的试剂盒具有操作简单，成本低，结果判断简单容易，灵 敏度高，本试剂盒检测基因突变灵敏度可以达到1%(即目的基因的突变基因DNA模板数占 野生型DNA模板数的1%);而直接测序中检测基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变 基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%);Taqman探针技术保障了试剂盒的检测为闭 管反应，有效的避免了假阳性的产生，其检测特异性也充分得到保证，而且检测快速方便， 整