人参特异性rapd标记的dna片段、鉴别人参的scar标记特异性引物对及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，具体涉及到一种 利用SCAR技术鉴定人参的特异性引物对及方法。
【背景技术】
[0002] 人参为五加科Araliaceae人参属Panax植物人参Panax ginseng C. A. Mey?的 干燥根和根茎，多于秋季采挖，洗净经晒干或烘干。栽培的俗称"园参"；播种在山林野生 状态下自然生长的称"林下山参"，习称"籽海"。主产于我国东北三省和朝鲜，被誉为"百 药之王"；具有大补元气、强心固脱、补脾益肺、安神生津的功效；用于体虚欲脱、肢冷脉微、 脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴等证；五加科人参属主要药用植物为：人参Panax ginseng C. A. Mey.、西洋参Panax quinquefolium L.和三七Panax notoginseng(Burkill)F. H. Chen ex C.Chow&W.G. Huang;西洋参主产于美国威斯康辛州和加拿大安大略省；我国市场上的西 洋参主要有两种：一种是进口，一种是引进种植。三七主产于云南、广西。三者都是我国常 用的珍贵药材，但其价格差异大；所以，市场上经常出现用其它根类药材，如商陆根、栌兰 根等充作人参。伪品不仅不具有药理作用，甚至可能产生毒副作用。
[0003] 传统的分析鉴别方法，是根据形态和组织结构特征和化学成分鉴别，而这些传统 的鉴别方法干扰因素较多，易受环境和植物本身的影响和限制；随着科学的不断前步，应用 DNA分子标记技术鉴定中药材及其饮片，取得了快速地发展，在中药材真伪鉴别中发挥了重 要的辅助鉴定作用。
[0004]RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)标记技术是建立在PCR基础之上，对 整个未知基因组序列进行多态性分析，已经广泛应用于品种鉴定、遗传分析等研宄，尤其适 合于寻找不同样品间的DNA差异。Shaw等首先采用RAH)方法区分人参属3种药材人参、 西洋参、三七。RAH)为10碱基的随机序列，通过PCR反应扩增基因组DNA，由于不同基因组 DNA序列碱基位点具有明显的差异，在不同区段上与引物发生结合的位点也不相同，因而扩 增条带的数量、强弱等特征均不同，产生不连续的DNA产物，获得较多的条带信息，从而使 不同的种表现出多态性；RAPD的优点是所需DNA量极少，操作简单，设备要求低，但是由于 RAH)引物只有10bp，退火温度较低，重复性相对较差。为了避免这一不足，将其转化为稳定 的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)标记。将RAPD转化成SCAR标记 技术是1993年Paran和Michelmore提出并应用的，已广泛应用于植物、生物等领域；SCAR 标记是在RAPD的基础上，对其特异片段进行回收、克隆和测序，根据测序序列设计特异性 引物，并以此引物对基因组DNA进行PCR扩增。具有操作简单、稳定、成本低等优点。张铭 采用RAPD技术获得了铁皮石斛基因组DNA的特异性SCAR标记，构建的特异性SCAR标记引 物扩增出特异性SCAR片段，可以用于鉴别铁皮石斛。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种人参特异性RAPD标记的DNA片段、鉴 别人参的SCAR标记特异性引物对及方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007] 所述人参特异性RAH)标记的DNA片段序列如SEQIDNO. 1所示。该DNA片段可 用于制备鉴别人参的试剂。
[0008] 所述鉴别人参的SCAR标记特异性引物对包括引物1和引物2,引物1和 引物2是根据权利要求1所述DNA片段设计的引物。优选地，所述引物1的序列为 5' -CCCGACTCAAAATCGAAGT-3'（SEQIDN0. 2)，所述引物 2 的序列为 5'-AAGCAAGAAGCAAGGG TAACATA-3'（SEQIDN0. 3)。
[0009] 所述鉴别人参的方法是用上述引物对对待测样品的DNA进行PCR扩增，若待测样 品获得2条特异性SCAR标记片段，则表明该待测样品为人参，所述2条特异性SCAR标记片 段中一条长度为280~320bp，优选300bp，另一条长度为100~150bp，优选130bp。所述PCR 扩增反应参数如下：PCR扩增反应体系总体积为25yL，PCR扩增反应体系包括：5XPrimer STARBuffer(Mg2+plus) 5yL，dNTPsmixture(2. 5mM) 2.5yL，引物 1(10yM) 0.75yL，弓| 物 2(10yM)0? 75yL，PrimeSTARHSDNAPolymerase(Takara，2. 5U/yL)0?25yL，DNA模 板1UL，无菌双蒸水补充至25yL;PCR扩增反应程序为：95°C预变性3min，98°C变性10s， 52°C退火15s，72°C延伸lmin，30个循环后，72°C延伸7min，4°C保存。
[0010] 本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物1和2,由于人参、西洋参及三七基因 组高度相似，要寻找其差异DNA片段是一个难点，因此本发明通过RAH)这个方法，获得了人 参有别于其它药材的差异性DNA序列，该序列是通过RAPD技术筛选获得的、仅在人参中能 获的特异性DNA片段，此前并未公开报道。本发明通过设计特异性引物通过PCR技术获得 了特异性标记的片段，结果可以将人参和其他药材区分。由于基因组的复杂性，该引物对在 人参模板DNA的PCR反应体系中还比预期多获得了一条扩增片段，本发明以特异带型作为 检出人参的判断标准。也有人RAH)方法对人参进行多样性分析，但是只做到了RAH)筛选 这个环节，却都没有设计出用于人参鉴别的特异性引物。本发明申请人经过多次的引物设 计、验证才获得这一对可以成功鉴别的引物。下面略举数例失败的引物对：
[0011] 5-CCCGACTCAAAATCGAAG-3(SEQIDNO. 4)
[0012] 5-TGTCATCCCCTTTGTGTTAA-3(SEQIDNO. 5)
[0013] 温度梯度55°0、57°0、59°0，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。
[0014] 5-CCCGACTCAAAATCGAAGT-3(SEQIDNO. 6)
[0015] 5-AAGCAAGAAGCAAGGGTAACATA-3(SEQIDNO. 7)
[0016] 温度梯度55°0、57°0、59°0，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。
[0017] 5-CCCCCGACTCAAAATCGAAGTAA-3(SEQIDNO. 8)
[0018] 5-GAAGCAAGAAGCAAGGGTAACA-3(SEQIDNO. 9)
[0019] 温度梯度50°〇、52°〇、54°〇，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。
[0020] 5-TGTCATCCCCCGACTCAAAAT-3(SEQIDNO. 10)
[0021] 5-TGTGTTAAATTTTGTATTCGT-3(SEQIDNO. 11)
[0022] 温度梯度55°0、57°0、59°0，人参、西洋参、三七各2个样本，无特异条带。
[0023] 而利用本发明所述的特异性引物，在PCR扩增条件下，所有的人参样本都获得 300bp和130bp的2条特异性SCAR标记片段，而在西洋参、三七、景天三七、栌兰、珠子参、水 田七、姜黄、竹节参、商陆以及所研宄的58种其他中药材中则无该特异性带型，均为阴性扩 增。需要说明的是，特异性引物SEQ-2和SEQ-3在人参均可获得特异性扩增，但若人参经糖 炮制后（为习称的红参或白参），只能在部分样本有效扩增。所有样本总计150批，其中： 人参药材50批（说明R1~R31是人参，R32~R50是经糖炮制过的人参，为习称的红参或 白参）；西洋参14批；三