黔北麻羊fshr基因单核苷酸多态性的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 繁殖性状是山羊的重要经济性状之一，繁殖性能高低直接关系到山羊养殖业生 产成本和生产效率。山羊产羔数低，是一个遗传力很低（0.1左右）的数量性状，如仅靠 传统育种技术很难改良这一性状。因此，在一些多胎的山羊品系中筛选和发掘影响多 胎性能的主效基因，并应用于多胎品系的选育，对提高山羊繁殖性能具有重要意义。促 卵泡素（Folliclestimulatinghormone,FSH)是重要的生殖类激素，与促卵泡素受体 (follicilestimulatinghormonereceptor,FSHR)结合发挥其生物学功能。FSHR是G 蛋白偶联受体超家族的成员之一，含10个外显子和9个内含子，仅第10外显子编码跨膜 域和胞内域。有研宄表明FSHR的不足可导致原发性不育，且在高繁殖力的山羊卵巢组织中 FSHR表达量显著高于低繁殖力的山羊。这些实验结果表明FSHR的数量可能与高繁殖力之 间呈正相关关系。对FSHR基因第10外显子的多态性研宄表明，FSHR的多态性对动物的产 羔(仔）数有重要的影响。近年来，国内外对动物和人的FSHR基因有许多报道，而关于黔北 麻羊FSHR基因多态性的研宄尚未见报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：提供一种黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性的检测方法，能准 确的检测出黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性，为进一步研宄黔北麻羊繁殖性状的遗传 机制提供依据。。
[0004] 本发明是这样实现的：黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性的检测方法，以引物对 P对黔北麻羊FSHR基因的第10外显子进行PCR扩增；并对PCR产物进行SSCP检测并对基 因分型，再对不同的基因型进行测序得到黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性序列；所述的 引物对P为：上游引物：5'-GCTGCTATGAAGTGCAAGCC，下游引物：5'-GACAGAGTCGATGGTGGCAT。
[0005] 所述的PCR扩增程序为：95 °C预变性3min;95 °C变性30s，57 °C退火30s，72 °C延伸30min，34个循环；最后72 °C延伸5min，4 °C保存。
[0006] 所述的SSCP检测是应用体积百分比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测；每 100ml上述聚丙烯酰胺凝胶中，包含32ml的30 %PAGE，5XTBE20ml，10%过硫酸铵720 yL，TEMED60yL，灭菌水 48ml。
[0007] 将得到黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性序列与产羔性状进行相关性分析。
[0008] 还包括对多态位点等位基因的基因频率、基因型频率、杂合度、纯合度、有效等位 基因数户多态信息含量的检测。
[0009] 由于采用了以上技术方案，本发明采用PCR-SSCP技术及PCR产物直接测序法对 FSHR基因多态性位点进行检测，以探寻FSHR基因多态性和表达量与产羔数之间的相关性， 为进一步研宄黔北麻羊繁殖性状的遗传机制提供依据。首次在黔北麻羊FSHR基因第10外 显子第1246bp发现C-A的碱基突变，BB基因型的产羔数与AA基因型和AB基因型差异 显著（P< 0.05)，而AA、BB基因型之间差异不显著（P> 0.05)，即BB基因型的产羔数显著 高于AA基因型和AB基因型。由此可知，FSHR基因是10外显子位点的变异影响黔北麻羊 的产羔数，该变异位点对产羔有显著的影响，因此在黔北麻羊育种中，可通过选择BB基因 型作为提高产羔数的辅助选择依据。本发明方法简单，易于实施，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】
[0010] 图1为黔北麻羊全基因组DNA琼脂糖凝胶检测结果； 图2为FSHR基因第10外显子部分片段扩增结果(最右边泳道为DL2000DNA Marker);图3为FSHR基因第10外显子PCR-SSCP多态性检测结果； 图4a和图4b分别为黔北麻羊FSHR基因第10外显子扩增片段AA和BB基因型测序峰 图。
【具体实施方式】
[0011] 本发明的实施例：黔北麻羊FSHR基因单核苷酸多态性的检测方法 1、基因组DNA提取 分别采取220头具有前3胎产羔记录的黔北麻羊血样，使用生工生物工程(上海）有限 公司的血液基因组DNA抽提试剂盒从黔北麻羊血液中提取基因组DNA，具体步骤如下： (1)取50-100 yL抗凝血液加入到1.5ml离心管中，在加入100 yL PBS Solution使总 体积为200 y L。
[0012] (2)加入 20yLProteinaseK，混匀。在加入 200yLBufferCL,震荡混匀，56°C 水浴10min。
[0013] (3)加入200 y L无水乙醇，充分颠倒混匀。
[0014] (4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸 附柱中，静置2min,在10000rpm室温离心1min,倒掉收集管中的废液。
[0015] (5)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 y L CW1 Solution, 10000 rpm离 心30s倒掉废液。
[0016] (6)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 yL CW2 Solution, 10000 rpm离 心30s倒掉废液。
[0017] (7)将吸附柱放回收集管中，于12000rpm室温离心lmin，离去残留的CW2 Solution〇
[0018] (8)取出吸附柱，放入一个新的1. 5ml离心管中，加入50yLCEBuffer静置3 min, 12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20°C 保存。
[0019] 部分基因组DNA电泳结果如图1所示，可知所提基因组DNA条带清晰，无拖尾现 象，说明DNA完整性好且浓度高，可作为后续试验PCR的模板使用。
[0020] 2、引物设计与合成 参照GenBank收录的绵羊全基因组序列（GenBank登录号：NC_019460. 1)，运用 Primier5. 0和Oligo软件对部分外显子10设计特异性引物，目的片段为242bp，引物由生 工生物工程(上海）股份有限公司合成。
[0021] 引物序列为： 上游引物：5' -GCTGCTATGAAGTGCAAGCC-3' 下游引物：5 ' -GACAGAGTCGATGGTGGCAT-3 ' 3、PCR扩增 PCR反应体系为：2XTaqPCRMasterMix10yL，DNA模板2yL，上、下游引物各 1. 5yL，加水至 20yL。
[0022] PCR扩增程序为：95 °C预变性3min;95 °C变性30s，57 °C退火30s，72 °C延伸 30min，34个循环；最后72 °C延伸5min，4 °C保存。
[0023]PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果如图2所示，扩增片段与目的片段 大小一致，条带单一，可用于后续试验。
[0024] 4、PCR_SSCP分析 将上述PCR扩增产物按照1 :1比例加入变性剂，变性后产物在体积百分比为10%聚丙 烯酰胺凝胶(每100ml上述聚丙烯酰胺凝胶中，包含32ml的30 %PAGE，5XTBE20ml，10% 过硫酸铵720yL，TEMED60yL，灭菌水48ml)中进行单链构象多态分析。对不同条带进 行基因分型，选取不同基因型个体进行克隆测序。
[0025] 4. 1聚丙烯酰胺凝胶 (1) 模具准备：玻璃板洗净烘干，用酒精将擦拭玻璃板内侧后放入制胶器 (2) 制胶及灌胶：在250mL的烧杯中依次加入：30%丙烯酰胺27mL、5XTBE20mL、 超纯水53mL、10 %过硫酸铵1400yL、四甲基乙二胺（TEMED) 10yL，混合均匀后缓慢灌 胶，