检测亚甲基四氢叶酸还原酶c677t多态性位点的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测亚甲基四氢叶酸还原 酶多态性位点的引物、试剂盒及其PCR方法，用于亚甲基四氢叶酸还原酶C677T多态性位点 的快速检测。
【背景技术】
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是细 胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四 氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与DNA的合成与甲基化作用。MTHFR基因存在的C677T 多态性，使得MTHFR的活性降低。在使用甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性时，如果患者 存在该变异，将造成严重的毒副反应。因此MTHFR基因多态性的检测对于个体化合理用药 具有重要的指导意义。
[0003] 缺血性脑卒中是老年人群中较为常见的一种脑血管疾病，其致残率和致死率高， 特别是在合并有高血压、糖尿病等危险因素的情况下，其发病率更高，给社会和家庭带来巨 大负担。近年来，我国缺血性脑卒中发病有年轻化趋势，青中年人群发病率明显增加。已有 研宄证实，同型半胱氨酸（Hey)升高已经成为缺血性脑卒中的重要指标，而MTHFR的677位 点C-T的突变，使得MTHFR产生热不稳定性缺陷，Hey升高，因此，MTHFRC67H多态性是 青年缺血性脑卒中的独立危险因子，当个体携带有风险等位基因时，脑卒中的发病率将比 普通人升高。当然，脑卒中等心脑血管疾病是遗传与环境因素相互作用的结果，通过改变饮 食结构、运动方式、生活习惯，可以延迟甚至避免疾病的发生，因此MTHFRC677T多态性的检 测能够提前预知个体罹患心脑血管疾病的危险程度，这对于脑卒中等心脑血管疾病的发病 风险预测和早期预防具有重要意义。
[0004] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-TaqmanMGB(MinorGrooveBinder)探针法；AS-PCR法；Cast-PCR法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0005] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0006] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[MolDiagnTher. 2010Jun1; 14(3): 163-9，UnitedStatesPatent 20120135406]。
[0007] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0008] 4)PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[ClinChimACqa. 2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStates Patent20110045479]〇
[0009]5 )PCR-TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[JClinMicrobiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0010] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0011] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatlAcad SciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[JVirolMethods. 2008Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的Ct(Cyclethreshold)不同而已，因此就引入了ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0012] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[ExpMolPathol. 2012Jun; 92 (3): 275-80;UnitedStatesPatent20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修饰的碱基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0013] 目前，国内已上市有注册证的亚甲基四氢叶酸还原酶基因检测试剂盒有如下 两种：1、深圳奥萨制药有限公司的"亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C/T检测试剂盒 (PCR-RFLP) "，国械注准20153400074 ;2、上海百傲科技有限公司的"MTHFR(C677T)基因检 测试剂盒（PCR-芯片杂交法）"，国食药监械（准）字2012第3401329号。
[0014] 厦门大学附属中山医院申请的"单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢 叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法"（申请号201410067910. 1)，采用多重PCR 扩增和焦磷酸测序的联合方法，定性检测两种基因的多态性位点；日本株式会社东芝在中 国申请专利"用于鉴定亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)基因型的核酸引物和探针"（公开 号CN101275165A)，采用LAMP扩增的方法检测MTHFR基因具有单核苷酸多态性的C677T 和A1298C位点；苏州旷远生物分子技术有限公司申请的"用于检测人MTHFR基因多态性 的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法"（公告号CN 102808026 B)，采用"等位基因特异 PCR"原理，在实时荧光定量PCR技术平台上检测亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因c. 665 与c. 1286两个多态性位点的核苷酸类型；郑州大学申请的"鉴定人MTHFR基因多态性 rs227