专利名称：普通水稻黑条矮缩病毒的rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种普通水稻病毒的检测方法，尤其涉及一种普通水稻黑条矮縮病毒 (rice black streaked dwarf virus, RBSDV)的RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)检测方 法。
背景技术：
普通水稻黑条矮縮病毒病是一种在江浙一带严重发生的病毒病，每年造成严重损 失。2008年分别有华南农业大学和浙江省农科院报告一种新的病毒病发生在广东和海南两 省，华南农业大学暂定名此病毒为南方水稻黑条矮縮病毒(southern rice blackstreaked dwarf virus, SRBSDV)，浙江省农科院暂定名为水稻黑条矮縮病毒2号(rice black streaked dwarf virus 2，RBSDV 2)。湖南省2009年大面积发生类似于这两种病毒病的矮 縮病，据初步统计发病面积在100万亩以上。 关于RBSDV的检测技术，此前曾有江苏农科院等研究单位根据此病毒第一片段 RNA的核苷酸序列设计一对引物对此病进行RT-PCR检测，不过发明者在实际检测工作中发 现这对引物检测效果不好，一是检测RBSDV阳性标本时电泳条带不甚清楚；二是特异性不 好，浙江普黑标本扩出了预期的约200bp的条带，而湖南的已证明是SRBSDV的标本也扩出 了约1500bp的条带，参见图1。 因此有必要建立一种能准确区分RBSDV与SRBSDV的检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种普通水稻黑 条矮縮病毒(rice black streaked dwarfvirus， RBSDV)的RT-PCR检测方法， 一种能准确 区分RBSDV与SRBSDV的方法。 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种普通水稻黑条矮縮病 毒的RT-PCR检测方法，其特点是该检测方法为以普通水稻黑条矮縮病毒特异性引物对待 测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为
正向引物5' -ATTACATTCCAAAGATGTTGCG-3'
反向引物5' -CTTCAAGAGTGTGTTGTTCCAG-3'。 与现有技术相比，本发明的优点是该方法所使用的一对引物是RBSDV第一段RNA 特异的，且有别于其它检测技术，可将RBSDV与SRBSDV两种病毒准确的区分开来。
图1是用现有的江苏农科院报告的普黑第一段RNA的引物做RT-PCR的电泳图。
图中从左至右的7条电泳带依次为l)Marker，2)健康对照，3)浙江普黑，4)湖南 南黑1，5)湖南南黑2， 6)湖南南黑3， 7)湖南南黑4。
图2是用本发明的特异性引物做RT-P CR的结果。
图中从左至右的电泳带依次为Marker，浙江黑条，健苗，湘阴南黑，隆回南黑，醴陵南黑，浏阳南黑，岳阳南黑，桃源南黑，汉寿南黑。(文中的普黑指普通水稻黑条矮縮病毒，南黑指南方水稻黑条矮縮病毒)
具体实施例方式
—、引物的设计 发明人利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI搜索并下载普通水稻黑条矮縮病毒第一段RNA及相近病毒第一段RNA的核苷酸序列，运用MEGA4. 0软件对这些序列进行比对，从扩展名为mas的文件中找出不同研究者报告的水稻黑条矮縮病毒核苷酸序列所共有而其它病毒序列均与之不同的引物候选区，设计出的一对特异性引物为
正向引物5' -ATTACATTCCAAAGATGTTGCG-3' 反向引物5' -CTTCAAGAGTGTGTTGTTCCAG-3'(反向引物使用时需颠倒互补)。
上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，预期的PCR产物为206个碱基。
二 、病毒的RT-PCR过程 病毒RNA的提取按双链RNA提取法(为现有技术)，其中水稻病株组织总RNA用总RNA分离试剂盒(华美生物工程公司)提取。RT-PCR扩增按宝生物工程(大连)有限公司PrimeScript OneSt印RT-PCR Kit
Ver. 2说明书进行。 RT-PCR反应体系如下 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 li 1 2X1 St印Buffer 25 ii 1 正向引物(20iiM) liil 反向引物(20iiM) liil 模板RNA 3 ii 1 RNase Free dH20 力口至50 ii 1 反应温度及时间如下
1.反转录(RT) :50。C 30min
2.变性94。C 2min 3.循环94。C 30sec，60。C 30sec，72。C lmin，共30循环。
三、PCR扩增产物的鉴定 取PCR扩增产物5 ii 1，点样于1. 2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)，以DL2， 000 DNAMarker Marker或50bp ladder marker作为标准分子参照，以120V的电压于0. 5XTAE电泳缓冲液中电泳40min，用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符。
四、PCR产物序列的鉴定 将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见下表l和下表2。 结果表明，与正向引物和反向引物的序列能100%覆盖且100%相同的全部是
RBSDV核苷酸序列。 表1普黑正向引物的BLAST结果
核苷酸序列
Rice black streaked dwarf vims seqment 1, complete se叫enceRice black-streaked dwarf virus ORF1 and ORFlr, 。enomic RNA
Schistosoma japonicumSchistosoma iapcmicumSchistosoma iaponicumSchistosoms japcmicumSchistosoma iapcmicumSchistosoma isponicurn
solate Anhui non-coinq mRNA clone S]FCE:solate Anhui ncm-coinq mRNA clone SJFCE:solate Anhui non-coinq mRNA done SJFCE:isolate Anhui non-coinq nnRNA done SJFCE:solate Anhui non-coinq mRNA clone SJFCA:solate Anhui non-coinq mRMA clone SJFCA:Schistosoma iaponicum SJCHGC05495 protein rnRWA, complete cdsMus rnusculus BAC clone RP23-31C10 from 13, complete sequenceHuman DMA sequence from clone RP1-179P9 on chromosome 6。22Mus musculus BAC clone RP23-425M9 from 17, complete sequence
蒗盖率
100%
100%
81%
81%
81%
81。/。
81%
81%
81%
81%
81%
81%
相同率
100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%
表2普黑反向引物的BLAST结果
核苷酸序列
Rice black streaked dwarf virus segment 1, comcilete seauence |I Rice black-streaked dwarf vims and 。RFlr, qenomic RNA |
I Pan troglodytes BAC clone CH251-616L15 from chromosome 7, con |I Mus musculus BAC clone RP23-281&4 from chromosome 16, compl' |I Homo sapiens BAC clone CTB-17C20 from 7, complete sequence |(Human DNA sequence from clone XXvac-36GH4 on chromosome 6 |I Human DNA sequence from clone RP11-537D2 on chromosome 6, c |i Xvlanimonas cellulosilvtica DSM 15894, complete qenome |I Soybean clone JCVI-FLGrn-16J23 unknown mRNAI Po叫lus trichocarpa predicted protein, mRWA
i Svnthetic construct Drosophila melano。aster clone encode |
由上可知，该对引物的特异性是非常好的，采用RT-PCR反应系统，能成功扩增出RBSDV特异性序列。
实施例1 : 用这对特异性引物对来自浙江的RBSDV病株和来自湖南8地的SRBSDV病株做RT-PCR，见图2，结果只有来自浙江的RBSDV病株为阳性，扩增出预期的206个碱基的条带。
说明了本发明的该对特异性引物对普通水稻黑条矮縮病毒是特异的，通过对RBSDV与SRBSDV病毒作RT-PCR，能将RBSDV与SRBSDV两种病毒准确的区分开来。
覆盖率相同率
100% 1100%
100% i100%
81% 1100%
81% i100%
81% 1100%
81% 1100%
81% 1100%
95% 195%
77% j100%
77% j100%
77% 1100%
权利要求
一种普通水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于该检测方法为以普通水稻黑条矮缩病毒特异性引物对待测样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为正向引物5’-ATTACATTCCAAAGATGTTGCG-3’反向引物5’-CTTCAAGAGTGTGTTGTTCCAG-3’。
2. 如权利要求1所述的普通水稻黑条矮縮病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述 特异性引物的设计是基于普通水稻黑条矮縮病毒第一段RNA的核苷酸序列，RT-PCR产物大 小为206bp。
全文摘要
一种普通水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarfvirus，RBSDV)的RT-PCR检测方法，所使用的一对引物是RBSDV第一段RNA特异的，是利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI搜索并下载RBSDV第一段RNA及相近病毒第一段RNA的核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，从mas文件中找出不同研究者报告的RBSDV核苷酸序列所共有而其它病毒序列均与之不同的引物候选区。经BLAST结果表明，与引物1和引物2能100％覆盖且100％相同序列的全部是RBSDV核苷酸序列。用这对引物对RBSDV与SRBSDV病毒作RT-PCR，能将RBSDV与SRBSDV两种病毒准确的区分开来。
文档编号C12Q1/70GK101713000SQ20091025429
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者高必达 申请人:湖南农业大学