一种免疫组化检测水稻条纹病毒在植株中分布的方法
【技术领域】：
[0001] -种免疫组化检测水稻条纹病毒在植株的方法，运用带毒灰飞虱接种植株（水 稻、拟南芥等），感病植物不同组织（根、茎、叶等）经过脱水、透明、石蜡包埋以及超薄切片 等过程获得组织石蜡切片，然后利用高度特异性水稻条纹病毒多克隆抗体，通过两步免疫 组化检测水稻条纹病毒在植物不同组织内的分布情况。
【背景技术】：
[0002] 由水稻条纹病毒（rice strip virus，RSV)引起的水稻条纹叶枯病是水稻重要病 害之一，主要发生在东亚的温带、亚热带地区，近年来在我国广大稻区大面积爆发，给水稻 生产带来严重威胁。RSV侵染水稻后最典型的外部症状是褪绿的条纹斑点或斑块，一般最早 出现在较幼嫩的新叶上，水稻常表现两种症状：卷叶型和展叶型。卷叶型表现为心叶褪绿、 捻转，并弧圈状下垂，严重的心叶枯死；展叶型表现为叶片出现黄绿色条带，病叶不捻转卷 曲，最后低垂和枯萎。生长早期感染的水稻植株，症状严重，甚至死亡，而后期感染的植株， 症状轻微。迄今为止，几乎没有能有效防治病毒病的化学药剂，治虫防病的应急措施无法作 为一项长期策略，而研究寄主在病毒侵染后基因的功能进而病害防控中加以利用则是一种 更为环保的手段。尽管已经鉴定了多个RSV编码蛋白功能，但RSV致病相关基因的功能鉴 定还有待进一步研究。要准确和可靠的鉴定病毒蛋白功能首先需要明确病毒在植物组织中 的分布。现有的研究多以RT-PCR或蛋白杂交等方法检测病毒在整株植株中的积累，而不能 在植株不同组织中检测病毒的分布，有必要尽快确立一种合适的方法以解决这一问题。
【发明内容】
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[0003] 本发明针对上述研究背景，以接种水稻条纹病毒的植株为材料，发明了一种免疫 组化检测水稻条纹病毒在植株中的分布情况。
[0004] 本发明所提供的免疫组化检测水稻条纹病毒在植株中的分布情况，其主要步骤如 下：
[0005] 1)利用对水稻条纹病毒高亲和性灰飞虱从水稻条纹病株中获毒；
[0006] 2)带毒灰飞虱接种植株（水稻、拟南芥等）；
[0007] 3)RT_PCR检测感染水稻条纹病毒的植株；
[0008] 4)感染水稻条纹病毒植株不同组织（根、茎、叶等）的石蜡切片；
[0009] 5)利用水稻条纹病毒多克隆抗体，通过免疫组化的方法检测水稻条纹病毒在植株 不同组织中的分布。
[0010] 本发明能为研究水稻条纹病毒侵染植株，在感病植株不同组织中的积累分布作出 准确和可靠的结果，其结果可以用于研究病毒与植物的分子互作。
【附图说明】：
[0011] 图1 DIBA检测灰飞虱携带水稻条纹病毒；
[0012] 图2水稻条纹病毒侵染拟南芥表型；
[0013] 图3 RT-PCR检测水稻条纹病毒在拟南芥中的积累；
[0014] 图4免疫组化检测水稻条纹病毒在拟南芥茎中的分布。
【具体实施方式】：
[0015] 下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0016] 实施例，免疫组化检测水稻条纹病毒在拟南芥茎中的分布
[0017]1、植物材料、病毒分析以及侵染方法
[0018] 水稻种子（日本晴）首先用0. 1%HgC12消毒1小时；然后用去离子水冲洗干净， 25°C浸种一天，催芽一天；催芽后的种子用木村B培养液中培养，光照14小时，黑暗10小 时，温度28±1°C。
[0019] 于江苏盐城、徐州、建湖等水稻条纹叶枯病重病区采集表现水稻条纹叶枯病症状 (江苏农业学报，2012,（28) :1007-1015)的水稻病株，利用水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基 因对应的引物（CP-F :ATGGGTACCAACAAGCC，CP-R :CTAGTCATCTGCACCTT)RT-PCR 方法检测检 测病株是否携带水稻条纹病毒。将1-2龄无毒灰飞虱若虫在毒源上饲毒2-3d，而后移入 育有武育粳3号秧苗的烧杯中饲养使其度过循回期，12-13d后从每杯中随机取出50头经 DIBA方法（南京农业大学硕士论文，2012,杜琳琳）测定其带毒率，用于测算有效接种虫量 [有效接种虫量（虫）=接种虫量（虫）X带毒率（％ )]。
[0020] 30天大小的拟南芥幼苗每棵接种10头有病毒的灰飞虱；接毒3天后，移除灰 飞虱，将幼苗移栽到温室中；取接病毒后的拟南芥叶片保存在-80°C冰箱中做后续研究 (RT-PCR方法确认侵染是否成功）。
[0021] 2、RNA 提取
[0022] 总RNA按照说明书用Trizol提取，并用NanoDrop 2000分光光度计检测浓度和质 量。只有260/280的比值在1. 9和2. 1之间且260/230的比值大于2. 0的RNA可以用作后 续的实验。RNA的完整性用琼脂糖凝胶电泳检测，所有的样品都标准化到同一浓度，用于后 续的实验。
[0023]3、反转录和RT-PCR检测
[0024] 取 2 μ g 经 DNase I 处理的总 RNA，用 M-MLV (Promega，Madison，WI，USA)合成 cDNA 第一链，具体操作步骤详见其操作手册，以cDNA作为RT-PCR模板。不同基因的表达水平 采用RT-PCR方法检测，同时以在真核生物中高度保守并组成性表达的EF1 α基因为内参。 具体操作步骤简述如下：分别取2 μ gRNA作模板，分别加入Random Primers 0. 5 μ g，定容 至15yL，70°C变性5min，立即在冰上放置5min。然后分别加入M-MLV 5Xbuffer 5yL， dNTP(25mM)5yL，RNAasin Rivonuclease Inhibitor 25U，M-MLV 反转录酶 200U，DEPC 水补 足25 μ L。42°C温育lh，95°C 5min灭活反转录酶活性。
[0025] 经过优化后，取适量的反转录产物用于随后的PCR。PCR引物序列见表1。PCR程 序如下：95°C，5min ;95°C 50s ;58°C 50s ;72°C 50s ;25-30 循环；72°C 10min。RT-PCR 产物经 纯化回收后，连接到pGEM-T easy vector上，送大连宝生物工程公司测序，BLAST分析。用 凝胶成像系统测定RT-PCR产物凝胶电泳溴化乙锭（EB)染色信号，估计基因表达相对水平。
[0026] 表1本研究所选用的水稻条纹病毒基因以及其引物序列
[0027]
[0028] 4、感染水稻条纹病毒拟南芥茎的石蜡组织切片
[0029] 感染水稻条纹病毒拟南芥茎在FAA固定液中4°C过夜，用30%~100%梯度乙醇脱 色后（每个梯度1-2小时），石蜡包埋，切片，切片厚度为1 μ m。1 %甲苯胺蓝染色后在光学 显微镜下观察并拍照。
[0030] 5、免疫组化检测水稻条纹病毒在拟南芥茎中的分布
[0031] 感染水稻条纹病毒拟南芥茎石蜡组织切片在二甲苯中脱蜡，5minX3,100%~ 30%梯度乙醇复水（每个梯度5111；[11\2)，3%!1 20210111；[11，水2111；[11\2，1\抗原修复液（碧 云天）95-100°C 20min，PBS 5minX2,封闭液处理10min，1000X水稻条纹病毒多克隆一抗 (兔 IgG)l_2h (室温）或 4°C过夜，PBS 2minX3,二抗 37°C30min，PBS 2minX3，DAB 显色 5-30min，最后用超纯水洗涤终止反应，在光学显微镜下观察并拍照。
[0032] 上述实施不以任何形式限定本发明。
【主权项】
1. 一种免疫组化检测水稻条纹病毒在植株中分布的方法，其特征在于：运用带毒灰飞 虱接种植株（水稻、拟南芥等），选取感病植株不同组织（根、茎、叶等）经脱水、透明、石蜡 包埋以及超薄切片等过程获得植株组织的石蜡切片，然后利用高度特异性水稻条纹病毒多 克隆抗体，通过两步免疫组化检测水稻条纹病毒在植株不同组织中分布情况。2. 按照权利1所获得一种免疫组化检测水稻条纹病毒在植株中分布的方法，其特征在 于：以水稻条纹病毒侵染的植株为对象，应用免疫组化方法检测病毒在植物不同组织（根、 茎、叶）水平上的积累情况，该方法可用于研究水稻条纹病毒与植物互作中病毒在植物组 织细胞中的积累模式。
【专利摘要】本发明公开了一种免疫组化检测水稻条纹病毒在植株中分布的方法。本发明运用高亲和灰飞虱从水稻条纹叶枯病株中获毒，然后通过带毒灰飞虱接种植株(水稻，拟南芥等)，RT-PCR检测水稻条纹病毒在植株中的积累，选取感病植株不同组织(根、茎、叶等)作石蜡切片，最后用水稻条纹病毒多克隆抗体免疫组化检测病毒在植株不同组织中的分布。与传统检测方法(RT-PCR、ELISA)相比，免疫组化方法能够检测病毒在植物组织水平上的积累。本发明可用于研究水稻条纹病毒与植物的分子互作模式。
【IPC分类】G01N33/569
【公开号】CN105388289
【申请号】CN201510793940
【发明人】孙枫, 方鹏, 杜琳琳, 兰莹, 刘之洋, 周彤, 周益军
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月16日