专利名称：水稻矮缩病毒第六号基因片段的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病毒的分子生物学领域，尤其涉及水稻矮缩病毒(RDV)非结构蛋白基因S6生物学功能的确定。
水稻矮缩病毒(RDV)基因组由12条双链RNA组成，基因组的总长度为25617bp，编码7个结构蛋白(P1，P2，P3，P5，P7，P8和P8’)和至少6个非结构蛋白(Pns4，Pns6，Pns9，Pns10，Pns11和Pns12)。这些非结构蛋白的功能还不清楚。由于RDV基因组结构复杂，并且不能机械传播。因此，在完整的植物呼肠孤病毒基因组中用反义遗传学的方法研究非结构蛋白基因的功能，如细胞间运动蛋白，是不可能的，导致目前都不能获得RDV及其他植物呼肠孤病毒的侵染性克隆。
植物病毒的细胞间运动是病毒对植物进行系统侵染所必需的一步。在不同种的病毒之间，它们行使细胞间运动的策略差异很大。通过对某些病毒的研究发现，它们的基因组能编码细胞间运动所必需的蛋白，而这些蛋白是通过改变细胞壁胞间连丝的通透直径来行使功能的。
水稻矮缩病毒第六号基因片段S6编码一个非结构蛋白Pns6，利用计算机软件对Pns6序列进行分析，发现它含有类似依赖于ATP的RNA解旋酶的保守模式。
为了找到RDV基因组中与细胞间运动有关的基因，发明人利用含有Gus报告基因的马铃薯X病毒细胞间运动缺陷型株pPVX25KmGUS与RDV基因组中各个基因组分进行互补试验的方法，证明运动缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在烟草叶片中的细胞间运动可以通过共表达RDVS6基因而得以互补恢复，而RDV基因组中其他基因组分不具备上述功能。在pPVX25KmGUS中，细胞间运动蛋白25K含有一个缺失突变导致缺失C端72个氨基酸，而不能进行细胞间运动。具体步骤为(1)将RDV-S6基因采用合适的限制性内切酶释放出来，克隆入带有CaMV35S启动子的植物瞬间表达载体，经过抗生素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRLRS6；(2)将上述表达质粒与含有Gus报告基因的马铃薯X病毒细胞间运动缺陷型株pPVX25KmGUS一起快速导入烟草叶片中，证明运动缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在烟草叶片中的细胞间运动可以通过共表达RDVS6基因而得以互补恢复，而RDV基因组中其他基因组分不具备上述功能。
此外，以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因在烟草叶片表皮细胞中瞬时表达S6基因和EGFP的融合基因，发现RDV基因S6编码蛋白(Pns6)以点状方式分布于细胞壁胞间连丝处，在细胞质中形成不规则的聚集体，而且可以进入细胞核中。具体步骤为(1)采用两步重组PCR的方法获得S6与增强型绿色荧光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因根据RDV S6基因和EGFP基因碱基序列，分别设计了两对引物，通过高保真PCR方法扩增出RDV S6基因和EGFP的融合基因片段，用PCR产物纯化试剂盒，将第一轮PCR产物回收，并以此产物为模板，用S6正向引物和EGFP反向引物进行第二轮PCR，最后得到S6和EGFP基因开放读码框融合的基因产物；(2)将PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因进行回收纯化，用KpnI酶切消化，克隆入带有CaMV 35S启动子的植物瞬时表达载体pRTL2(用NcoI和KpnI两种酶切开)中。经过氨卞青霉素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRTL2RS6-EGFP；(3)将目的基因S6-EGFP快速导入烟草叶片，发现RDV基因S6编码蛋白(Pns6)以点状方式分布于细胞壁胞间连丝处，在细胞质中形成不规则的聚集体，而且可以进入细胞核中。
对RDV侵染水稻叶片的免疫组织化学分析结果均表明Pns6在RDV侵染的水稻叶片中具有相同的亚细胞定位，证明Pns6在细胞中的分布具有运动蛋白分布的典型特征。
本发明关于水稻矮缩病毒(RDV)非结构蛋白基因S6生物学功能的确定，是有关双链RNA植物病毒细胞间运动蛋白的首次报道。水稻矮缩病毒第六号基因片段S6基因生物学功能的确定，有助于更深一步的了解水稻矮缩病毒系统侵染植物的机制，从而获得更强的抗RDV植株，有广泛的农业利用价值。本发明通过对RDV S6基因生物学功能的研究，确定非结构蛋白Pns6可以行使细胞间运动蛋白的功能，有很大的理论和应用价值，有助于对RDV侵染植物及其细胞间运动机制的进一步了解，从而更有效地防治水稻矮缩病。
实例1.
利用含有Gus报告基因的马铃薯X病毒细胞间运动缺陷型株pPVX25KmGUS与RDV基因组中各个基因组分进行互补试验的方法，证明运动缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在烟草叶片中的细胞间运动可以通过共表达RDVS6基因而得以互补恢复，而RDV基因组中其他基因组分不具备上述功能。在pPVX25KmGUS中，细胞间运动蛋白25K含有一个缺失突变导致缺失C端72个氨基酸，而不能进行细胞间运动。具体步骤为(1)包含RDV-S6基因的植物瞬时表达载体克隆的构建将RDV-S6基因采用合适的限制性内切酶(BamHI和PstI)释放出来，克隆入带有CaMV 35S启动子的植物瞬间表达载体。经过抗生素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRLRS6。
(2)将上述表达质粒与含有Gus报告基因的马铃薯X病毒细胞间运动缺陷型株pPVX25KmGUS一起利用基因枪快速导入烟草叶片中把5μl表达质粒DNA(1.0μg/μl)用2.5M Cacl2和0.1M亚精胺沉淀附着在3mg的金颗粒(1μm)上。用70％乙醇洗涤质粒DNA包裹的金颗粒，并使之悬浮于无水乙醇中。超声处理后取20μl混合物待金颗粒干燥后高压轰击烟草叶片(PDS-1000型基因枪，Bio-Rad)。
发现运动缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在烟草叶片中的细胞间运动可以通过共表达RDVS6基因而得以互补恢复，而RDV基因组中其他基因组分不具备上述功能。从而证明RDVS6基因编码蛋白质具有细胞间运动功能。实例2.
以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因在烟草叶片表皮细胞中瞬时表达S6基因和EGFP的融合基因，发现RDV基因S6编码蛋白(Pns6)以点状方式分布于细胞壁胞间连丝处，在细胞质中形成不规则的聚集体，而且可以进入细胞核中。具体步骤为(1)RDV S6-GFP融和基因的获得采用两步重组PCR的方法获得S6与增强型绿色荧光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因。
A.根据RDV S6基因和EGFP基因碱基序列，分别设计了两对引物，分别为S6正向引物5’AAA ATG GAC ACA GAA ACT CTT TGC-3’S6反向引物5’CC TCG CCC TTG CTC ACC ATT TTG TAC ACG GTA ATA GCA-3’此引物包含S6基因3’端互补序列和EGFP基因的起始序列。
EGFP正向引物5’TGC TAT TAC CGT GTA CAAAAT GGT GAG CAA GGG CGA GG-3’此引物与S6反向引物互补。
EGFP反向引物5’GTC GGT ACC TTT ACT TGT ACA GCT CGT CC-3’此引物包含一个KpnI酶切位点。
B.根据基因工程方法我们设计了两步重组PCR方法，采用了合适的条件，得到了S6-EGFP融合基因。
实验方法如下通过高保真PCR方法扩增出RDV S6基因和EGFP基因片段，用PCR产物纯化试剂盒(购自Qiagen公司)，将第一轮PCR产物回收，并以此产物为模板，用S6正向引物和EGFP反向引物进行第二轮PCR，最后得到S6和EGFP基因开放读码框融合的基因产物。
(2)包含RDVS6-GFP融合基因的植物瞬时表达载体克隆的构建将PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因进行回收纯化，用KpnI酶切消化，克隆入带有CaMV 35S启动子的植物瞬时表达载体pRTL2(用NcoI和KpnI两种酶切开)中。经过氨卞青霉素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRTL2RS6-EGFP。
(3)利用基因枪将目的基因S6-EGFP快速导入烟草叶片把5μl表达质粒DNA(1.0μg/μl)用2.5M Cacl2和0.1M亚精胺沉淀附着在3mg的金颗粒(1μm)上。用70％乙醇洗涤质粒DNA包裹的金颗粒，并使之悬浮于无水乙醇中。超声处理后取20μl混合物待金颗粒干燥后高压轰击烟草叶片(PDS-1000型基因枪，Bio-Rad)。
发现RDV基因S6编码蛋白(Pns6)以点状方式分布于细胞壁胞间连丝处，在细胞质中形成不规则的聚集体，而且可以进入细胞核中。
权利要求
1.水稻矮缩病毒第六号基因片段，属于细胞间运动蛋白。
2.如权利要求1所述的水稻矮缩病毒第六号基因片段，其生物学功能的确定方法包括以下步骤(1)将RDV-S6基因采用合适的限制性内切酶释放出来，克隆入带有CaMV 35S启动子的植物瞬间表达载体，经过抗生素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRLRS6；(2)将上述表达质粒与含有Gus报告基因的马铃薯X病毒细胞间运动缺陷型株pPVX25KmGUS一起快速导入烟草叶片中，证明运动缺陷型病毒株pPVX25KmGUS在烟草叶片中的细胞间运动可以通过共表达RDVS6基因而得以互补恢复，而RDV基因组中其他基因组分不具备上述功能。
3.如权利要求1所述的水稻矮缩病毒第六号基因片段，其生物学功能的确定方法包括以下步骤(1)采用两步重组PCR的方法获得S6与增强型绿色荧光蛋白(EGFP，Clontech)的融合基因根据RDV S6基因和EGFP基因碱基序列，分别设计了两对引物，通过高保真PCR方法扩增出RDV S6基因和EGFP基因片段，用PCR产物纯化试剂盒，将第一轮PCR产物回收，并以此产物为模板，用S6正向引物和EGFP反向引物进行第二轮PCR，最后得到S6和EGFP基因开放读码框融合的基因产物；(2)将PCR得到的RDV S6-EGFP融合基因进行回收纯化，用KpnI酶切消化，克隆入带有CaMV 35S启动子的植物瞬时表达载体pRTL2(用NcoI和KpnI两种酶切开)中，经过氨卞青霉素筛选以及酶切鉴定后确认得到了植物瞬时表达质粒pRTL2RS6-EGFP；(3)将目的基因S6-EGFP快速导入烟草叶片，发现RDV基因S6编码蛋白(Pns6)以点状方式分布于细胞壁胞间连丝处，在细胞质中形成不规则的聚集体，而且可以进入细胞核中。
4.如权利要求1所述的水稻矮缩病毒第六号基因片段，其细胞间运动功能的应用开发。
全文摘要
本发明涉及水稻矮缩病毒rice dwarf virus(RDV)非结构蛋白基因S6生物学功能及其确定方法。水稻矮缩病毒第六号基因片段S6编码一个非结构蛋白Pns6,利用马铃薯X病毒Potato Virus X(PVX)细胞间运动缺陷株的侵染性克隆与RDV编码的非结构蛋白基因进行的互补试验表明RDV S6编码的非结构蛋白是RDV的细胞间运动蛋白。Pns6的细胞内定位研究表明S6蛋白定位于植物细胞壁胞间连丝处,具有运动蛋白的典型特征。S6基因生物学功能的确定,有助于更深一步的了解水稻矮缩病毒系统侵染植物的机制,从而获得更强的抗RDV植株,有广泛的农业利用价值。
文档编号C12N15/46GK1344797SQ0113472
公开日2002年4月17日 申请日期2001年11月9日 优先权日2001年11月9日
发明者李毅, 魏春红, 吴刚, 刘慧君 申请人:北京大学