一种抑制水稻矮缩病毒侵染的方法

专利名称：：一种抑制水稻矮缩病毒侵染的方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制水稻矮縮病毒侵染的方法。
背景技术：
：病毒是一种严格的细胞寄生物，病毒与宿主的相互作用关系是病毒学面临的重要课题。病毒与宿主细胞表面受体结合后，通过各自的方式进入宿主细胞，利用宿主细胞的某些蛋白因子完成其一系列高度调控的复制、转录过程，并引起宿主细胞信号传导途径的变化，导致宿主细胞裂解、凋亡或使病毒处于隐性潜伏感染状态等。病毒作为宿主细胞的外来物质，一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制作用，保护宿主细胞免受病毒感染的侵犯；另一方面，病毒会主动地对宿主细胞的分子事件和某些蛋白因子进行修饰，使宿主细胞能为病毒感染和复制提供必需的细胞机器。病毒进入细胞的方式有很多种，囊膜类病毒可以通过囊膜与宿主细胞膜融合的方式进入宿主细胞，非囊膜类病毒的研究比较少，已经有研究表明某些非囊膜类病毒通过外壳蛋白裂解后暴露出疏水性末端插入宿主细胞脂膜，从而帮助病毒进入细胞，也有实验表明，某些病毒编码具有膜融合功能的蛋白帮助病毒穿过细胞膜。这方面的研究进展将为病毒病的预防和治疗提供理论依据。水稻矮縮病毒(ricedwarfvirus,RDV)为等轴粒体，直径70nm，具有32个衣壳蛋白亚单位，为双链RNA病毒。只侵染水稻和少数几种禾本科植物。水稻矮縮病毒RDV病毒粒子内有单拷贝基因组12条双链RNA，依次命名为Sl到S12。组成病毒颗粒的蛋白称为结构蛋白，是由S1、S2、S3、S5、S7、S8和S9分别编码的蛋白P1、P2、P3、P5、P7、P8和P9。P2是病毒粒子最外层壳的组成部分。
发明内容本发明的目的是提供一种抑制水稻矮縮病毒侵染的方法。本发明所提供的抑制水稻矮縮病毒侵染的方法，是种植导入了选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段和具有所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段的反向重复序列的片段的水稻矮缩病毒宿主植物。所述P2蛋白的编码基因的核苷酸序列为GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至3461位核苷酸。所述方法中，所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段是核苷酸序列为GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至540位核苷酸的片段。所述方法中，所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段和具有所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段的反向重复序列的片段是通过pCAMBIA1301转入所述水稻矮縮病毒宿主植物。所述方法中，所述宿主植物为水稻。本发明的方法通过抑制了水稻矮縮病毒P2蛋白膜融合作用，可以有效的阻止水稻矮縮病毒黏附到宿主昆虫细胞表面并穿过细胞膜进入细胞，有效的抑制了该病毒的侵染，对于病毒防治具有很好的效果，实验证明，本发明的方法，明显抑制了水稻矮缩病毒对叶蝉的侵染，从而有效降低了水稻感病率。图1为P2-vsvg和P8-vsvg在Sf9细胞表面的表达的杂交印迹和免疫荧光检测结果。图2为P2在细胞表面表达经酸处理后介导的膜融合作用实验结果。图3为P2在细胞表面表达经酸处理后介导的膜融合不受P8的影响。图3中，A图、B图、C图依次为重组杆状病毒S2感染的细胞、重组杆状病毒S8感染的细胞与重组杆状病毒S8和S2感染的细胞酸处理0h照片；E图、F图、G图依次为重组杆状病毒S2感染的细胞、重组杆状病毒S8感染的细胞与重组杆状病毒S8和S2感染的细胞酸处理4h照片。图4为RDV侵染宿主细胞后可以导致多胞体现象发生。图4中，A图为RDV侵染后3天的宿主细胞，B图为RDV侵染后5天的宿主细胞。图5为e-MCD抑制水稻矮縮病毒侵染叶蝉。图5中A为处理后细胞，B为未处理细胞。具体实施例方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。本发明发明人的研究证实，在昆虫细胞(Sf9)表面表达P2模拟它在病毒粒子表面的状态，发现在酸性环境下P2能够介导多胞体的产生，因此推测P2具有类似膜融合蛋白的作用。即水稻矮縮病毒外壳蛋白P2(RDV-P2)可以通过其膜融合作用，帮助RDV进入宿主细胞，开始复制。根据这一结果，在宿主细胞内抑制细胞膜融合作用的发生，可以有效的阻止病毒进入宿主细胞并开始其复制，对于病毒防治具有十分重要的意义。具体实验如下所述。实施例l、抑制水稻矮缩病毒(RDV)的外壳蛋白P2的膜融合功能可以抑制水稻矮縮病毒侵染蚜虫的验证一、水稻矮縮病毒外壳蛋白P2和/或P8在昆虫细胞表面的表达利用pAcTMvsvg系统，将P2和/或P8蛋白在Sf9细胞中进行了表达，表达后的目的蛋白会在其N端的pAcTMvsvg质粒中gp64导肽的引导下穿过细胞膜分泌到细胞夕卜，其C端的vsvg跨膜结构域能够将目的蛋白固定在细胞膜上，从而使该蛋白表达在细胞表面上。具体的实验方法如下1、可表达P2和/或P8的重组Bacmid的制备以水稻矮縮病毒(从云南发病的水稻材料中提取)的dsRNA基因组反转录得到的cDNA为模板，用引物F1:5'-ATTAGGCCATTATGGCCATATGGCTTATCCTAATGACGT3'和Rl:5'-AATTGGCCGAGGCGGCCCAATGCATCATAGATAGA3'进行PCR扩增，扩增得到片段，经测序表明，该片段具有RDVS2基因的全长0RF(GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至3461位核苷酸)的核苷酸序列，RDVS2基因编码P2蛋白。以水稻矮縮病毒的dsRNA基因组反转录得到的cDNA为模板，用引物F2:5'-ATCAGGCCGAGGCGGCCATCCATATAGTTCGTGATCAA3'和R2:5'_GCTAGGCCGAGGCGGCCATTTGGTCTATAGTATCT3'进行PCR扩增，扩增得到的片段，经测序表明，该片段具有RDVS8的全长ORF(GenBankAccessionNumber为NC—003764的自5'端第22位至1287位核苷酸)的核苷酸序列，RDVS8基因编码P8蛋白。将上述PCR扩增得到的S2或S8的全长0RF经Sfil酶切后，插入到质粒pAcTMvsvg(购自Invitrogen公司)的Sfil酶切位点，经测序确认序列，将测序表明含有RDVS8的全长0RF的重组载体命名为pAcTMS8;将测序表明含有RDVS2的全长0RF的重组载体命名为pAcTMS2。取DH10Bac(购自Invitrogen公司)感受态细胞(其中含有一个杆状病毒穿梭载体，简称Bacmid,还有一个助手质粒)100PL，冰上融化，分为两组，分别加入10ng(2ul)重组供体质粒pAcTMS2或pAcTMS8，轻柔混匀，冰上30分钟，42。C热击45秒，冰浴2分钟，加入900mlS0C培养基(含有质量百分含量为2%蛋白胨，质量百分含量为0.5%酵母抽提物，10mMNaCl，2.5mMKC1，lOmMMgCl2，lOmMMgS04,20rnM葡萄糖的培养基)，37。C摇床(225rpm)培养4小时后，分别将加入pAcTMS2或pAcTMS8重组质粒的菌液分别进行10，102，103倍依次稀释，分别从每种稀释液中取出100叱涂于LuriaAgar固体培养基(在LB固体培养基的基础上添加50Pg/ml卡那霉素，7Pg/ml硫酸庆大霉素，10Pg/ml四环素，柳g/mlX-gal和卿g/mlIPTG)，37°C培养24小时。用牙签挑取上述培养的LuriaAgar平板上的白斑(蓝斑做为负对照)，进行菌落PCR检测。使用bacmid载体特异的PUC/M13正向引物(5，-GTAAAACGACGGCCAG-3，)和S2基因特异的反向引物Rl筛选含有S2基因的全长0RF的重组Bacmid。使用bacmid载体特异的PUC/M13正向引物(5，-GTAAAACGACGGCCAG-3')和S8基因特异的反向引物R2筛选含有S8基因的全长0RF的重组Bacmid。结果筛选到PCR扩增产物为1600bp+外源片段长度(3350bp)的带有S2基因的全长ORF的重组Bacmid，将验证正确带有S2基因的全长ORF的重组Bacmid命名为Bacmid-S2;PCR扩增产物为1600bp+外源片段长度(1300bp)的带有S8基因的全长ORF的重组Bacmid，将验证正确带有S8基因的全长ORF的重组Bacmid命名为Bacraid-S82、含有S2和/或S8基因重组BacmidDNA的制备提取含有S2基因的全长ORF的重组BacmidDNA、含有S8基因的全长ORF的重组BacmidDNA，具体方法为分别挑PCR鉴定阳性的Bacmid-S2、Bacmid-S8的白色菌落，于3mlLB培养基(含50Pg/ml卡那霉素，7Pg/ml硫酸庆大霉素，10Pg/ml四环素)，37t:摇床(250-300rpm)培养16个小时。取1.5ml培养物离心(12，OOOrpm，l分钟)，弃上清，加0.3mlsolutionI(15mMTris-HC1(pH8.0)，10mMEDTA，100ug/mlRNaseA),轻柔重悬菌体，再力口0.3mlsolutionII(0.2NNaOH，1%SDS),上下颠倒混匀，室温放置5分钟，慢慢加入O.3ml3M醋酸钾(pH5.5)，冰浴5—IO分钟，13，000rpm,离心10分钟，取上清，加入0.8ml异丙醇轻柔混匀，冰浴5一10分钟，13,000rpm，离心15分钟，弃上清，用体积百分含量为70%的乙醇溶液洗涤，超净台内吹干，溶于40ul无菌TE(pH8.0)中，分别得到含有S2基因的全长0RF的重组BacmidDNA和含有S8基因的全长0RF的重组BacmidDNA。3、含有S2或S8基因的全长0RF的重组BacmidDNA的重组杆状病毒的制备1)昆虫Sf9细胞的培养Sf9细胞培养液为含有体积百分含量为10%的热灭活胎牛血清(FBS)的TNM-FH培养基(TNM-ra完全培养基购自GIBCL公司)。培养条件为27°C，细胞无菌室内，25cm2细胞培养瓶、5mL培养液单细胞贴壁培养。待细胞长至90%覆盖率后(一般3天左右)，无菌条件下l:5(细胞培养基，体积比)传代。2)重组BacmidDNA转染Sf9细胞获得重组杆状病毒下述转染试验中，所用培养液均不含血清和抗生素。A、DNA-CELLFECTIN混合液的制备配制A液和B液；A液分别将10ul步骤2制备的含有S2基因的全长0RF的重组BacmidDNA、含有S8基因的全长0RF的重组BacmidDNA加入到90ulTNM-FH培养液中；B液:将20ulCELLFECTIN转染试剂(Invitrogen)加入到80ulTNM-FH培养液中。将含有S2基因的全长0RF的重组BacmidDNA或含有S8基因的全长0RF的重组BacraidDNA配制的A溶液分别与B溶液等体积混合，轻轻弹击使之混匀，室温下放置30—45分钟，分别得到含有S2基因的全长0RF的重组BacmidDNA或含有S8基因的全长0RF的重组BacmidDNA的DNA-CELLFECTIN混合液。B、重组杆状病毒贮液的制备再装有2mlT丽-FH完全培养基的细胞培养皿(35mm)中分别接种1X106个按照步骤1)方法培养的Sf9细胞，27。C培养l一2小时，使之贴壁。用无血清T丽-FH完全培养液浸洗待转染贴壁细胞2—3次，吸去培养液，用步骤A所述方法制备的DNA-CELLFECTIN混合液分别覆盖在一个细胞培养皿中的Sf9细胞上，补充加入0.2mlTNM-ra培养液，27。C静置培养5小时。吸去转染溶液，加入2ml含体积百分含量为10X的FBS和50ug/mlgentamicin的TNM-FH完全培养液，27。C培养约4一5天，收集培养液上清，1，OOOrpm，离心5分钟去除细胞，上清即为含有S2基因的全长ORF的重组BacmidDNA或含有S8基因的全长ORF的重组BacmidDNA的初代重组杆状病毒贮液，将验证真确的含有S2基因的全长ORF的重组BacmidDNA或含有S8基因的全长ORF的重组BacmidDNA的初代重组杆状病毒分别命名为重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8;可在4'C保存，一7(TC长期保存。重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8可侵染Sf9细胞，将P2和/或P8蛋白在Sf9细胞中进行表达，表达后的目的蛋白会在其N端的pAcTMvsvg质粒中gp64导肽的引导下穿过细胞膜分泌到细胞外，其C端的vsvg跨膜结构域能够将目的蛋白固定在细胞膜上，从而使该蛋白表达在细胞表面上。4、水稻矮縮病毒外壳蛋白P2和/或P8在昆虫细胞表面的表达1)重组杆状病毒的扩增按照步骤3中步骤1)的方法培养Sf9细胞，待Sf9细胞培养至70—80X覆盖率，吸掉培养液，分别加入步骤3中获得的重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8接种液(接种体积如下所述)，使之覆盖整层细胞，27"C培养1小时后，补加含10%胎牛血清(FBS)的完全细胞培养液，27。C静置培养3—5天后收获病毒，病毒得到约100倍的扩增。其中，接种重组杆状病毒储液体积由以下公式决定MOIX总细胞量接种液体积(mL)=-病毒滴度)其中，MOI(MultiplilityofInfection):感染系数，M0I=0.01-0.2pfu/cell，cell是指细胞个数pfu(plaqueformationunit):空斑形成单位，由于病毒进行裂解细胞，而在营养琼脂平板上形成的透明空斑。病毒滴度用组织培养半数感染量法测定。2)RDVP8、P2蛋白(P2-vsvg和P8-vsvg蛋白)的表达重组杆状病毒侵染Sf9细胞表达目的蛋白(按照文献(L.A.King,R.D.Possee,7%e^fec〃7oF"ir〃s^xpressiOTALaboratoryGuide(ChapmanandHall,London).(1992).)所述方法进行)，具体方法如下所述接种lX106个Sf9细胞于35mm培养皿中，培养过夜，去除培养液，分别加入上述扩增得到的重组杆状病毒S2或重组杆状病毒S8接种液(M0I4—10pfu/ce11)，同时以等量(M0I=5—10pfu/cell)野生型杆状病毒(Wild-typeAcNPV，WT)(Invitrogen)侵染Sf9细胞作为负对照，27°C1小时后，分别吸出病毒液，加入2mLT腿-FH完全培养基，27。C继续培养Sf9细胞，24，48，72小时后，分别收获重组杆状病毒S2或重组杆状病毒S8侵染表达后的Sf9细胞，1，000rpm，离心2分钟，细胞沉淀立即按照下述方法进行蛋白表达检测。3)P2-vsvg和P8-vsvg蛋白表达Westernblot检测a、将步骤2)收集的感染了重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8表达的Sf9细胞、野生型杆状病毒感染的Sf9细胞、或未感染病毒的Sf9细胞分别用PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)洗一遍，ddH20(30ul/lXl(f个细胞)悬浮，加入等体积2XSDS上样缓冲液(含有lOOramol/LTrisCLPH6.8，质量百分含量为4%的SDS,质量百分含量为0.2%的溴酚蓝，体积百分含量为20%的甘油，和质量百分含量为5%的巯基乙醇(使用前补加)的溶液)，混匀，10(TC煮沸5分钟，自然冷却后离心收集上清。b、将步骤a得到的上清，均分别用两块相同浓度的聚丙烯酰胺凝胶(10%的分离胶和5%的浓縮胶)，恒流20mA,电泳分离蛋白，上样量为20"L。c、电泳结束后，将一块凝胶用考马斯亮兰R-250染色；另一块凝胶进行电转，在电转移缓冲液(含有39腿ol/L的甘氨酸，48mmol/L的Tris，质量百分含量为0.037。/。的SDS，和体积百分含量为20%的甲醇的溶液)中把蛋白质电转移到PVDF膜上(200raA，1-2h)。转移结束后，用PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)洗膜1次，然后在封闭液(含有质量百分含量为1%的BSA，质量百分含量为0.05Q/o的Tween20，和质量百分含量为的0.3%TritonX-100的PBS缓冲溶液(每升含8gNaCl,0.2gKC1，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4))中封闭过夜。将膜放入杂交袋中，按0.lml/cm2的量加入封闭液，再加入anti-histag的一抗(Sigma公司)(1:1000),室温温育lh。去掉一抗，用PBST(含有质量百分含量为O.ly。Tween20的PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa風，0.24gKH2P04，pH7.4))缓冲液洗膜3次，每次10min，再用TBST缓冲液(含50raMTris-HCl，150mMNaCl，质量百分含量为0.1%的Tween20，pH7.5的溶液)洗涤lOmin。将膜放入杂交袋中，按0.lml/cm2的量加入二抗(鼎国试剂有限公司，检测P2和P8的抗体各是his抗体)稀释液(用含质量百分含量为1%的BSA的TBST稀释)，再加入碱性磷酸化酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1:7500)，室温温育lh。用TBST洗3次，每次10分钟。在7.5ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/LTrisCIpH9.5，100mmol/LNaCl，5画1/LMgCl2)中加入33WNBT(氮兰四唑)溶液和副BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)溶液，混匀，把膜放入上述显色混合液中，室温避光显色至出现清晰条带，用大量蒸馏水冲洗终止反应。结果如图1中A所示，泳道l为重组杆状病毒S8侵染的Sf9细胞总蛋白，泳道2为未侵染Sf9细胞总蛋白，泳道3为野生型杆状病毒侵染的Sf9细胞总蛋白，Westernblot检测表明P2-vsvg和P8-vsvg在Sf9细胞得到了表达。4)P2-vsvg和P8-vsvg蛋白表达免疫荧光细胞定位检测使用P2抗体(水稻矮縮病毒P2蛋白抗体是以大肠杆菌表达纯化的水稻矮縮病毒P2蛋白为抗原，按照常规方法免疫兔子得到的抗血清。水稻矮縮病毒P2蛋白按照如下方法制备以RDV基因组cDNA为模板，PCR得到RDVP2编码区序列(GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至3461位核苷酸)，插入质粒pET-21d(+)(购自Novagen公司)的限制性内切酶Ncol及和BamHI位点间构建成表达载体，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，表达产物用S-S印harose纯化，得到水稻矮縮病毒P2蛋白)和P8抗体(水稻矮縮病毒P8蛋白抗体是以大肠杆菌表达纯化的水稻矮縮病毒P8蛋白为抗原，按照常规方法免疫兔子得到的抗血清。水稻矮縮病毒P8蛋白按照如下方法制备以RDV基因组cDNA为模板，PCR得到RDVP8编码区序列(GenBankAccessionNumberNC—003764的自5'末端第22位至1287位)，插入质粒pET-21d(+)(购自Novagen公司)的限制性内切酶NcoI及和BamHI位点间构建成表达载体，转化入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，表达产物用S-S印harose纯化，得到水稻矮縮病毒P8蛋白)分别对重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8感染Sf9细胞表达的P2-vsvg和P8-vsvg蛋白进行了免疫荧光检测，免疫荧光检测的步骤如下所述a、在12孔细胞培养皿中加入10X10mm2盖玻片，分别接种步骤2)所述的方法表达后的含有S2基因的重组BacmidDNA、含有S8基因的重组BacmidDNA的重组病毒侵染后的Sf9细胞，使细胞能够在盖玻片上生长，27°Cl小时后，分别吸出病毒液，加入2mLTNM-ra完全培养基，27。C继续培养Sf9细胞，24，48，72小时。b、分别吸尽细胞培养皿中的细胞培养液，12孔板每孔用量加lral-2(TC预冷的甲醇，-20。C固定7-15min。用lmlPBS(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO"0.24gKH2P04，pH7.4)洗3次，每次约5min，水平摇晃洗去甲醇。用0.5ml含有质量百分含量为5%的BSA的PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)室温封闭15min。lmlPBS(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa風，0.24gKH2P04，pH7.4)洗1次，水平摇晃。c、用含有质量百分含量为1%的BSA的PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKC1，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)配备一抗(mouse-His，抗体和缓冲液的体积比为l:300)液，一抗稀释比例依抗体种类而定。；加一抗50-100ul/玻片。在一空盒中放一张吸水纸，喷适量水，将12孔板放入。37X:温育l-2h。lmlPBS(每升含8gNaCl,0.2gKC1，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)洗3次，每次约5min，水平摇晃。d、用含有质量百分含量为1%BSA的PBS缓冲液(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)配备二抗液，二抗稀释比例1:200。加二抗50-100ul/玻片。在一空盒中放一张吸水纸，喷适量水，将12孔板放入。37。C温育lh。注意由于二抗偶联了荧光基团，操作时注意避光。用lmlPBS(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04,0.24gKH2P04，pH7.4)洗3次，每次约5min，水平摇晃。e、用PBS(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)配备染核试剂(5ulDAPI/lmlPBS)，室温对细胞染色5-lOmin。lmlPBS(每升含8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4)洗3次，每次约5min，水平摇晃。用lmlH20洗去PBS(每升含8gNaCl，0.2gKC1，1.44gNa2HP04，0.24gKH2P04，pH7.4);用50%甘油封片，用指甲油密封玻片四周。在荧光/激光共聚焦显微镜下进行观察。结果如图1中B、C所示，结果表明，红色荧光都呈现于细胞表面。结果说明P2和P8都在细胞表面得到表达。图1中B为表达P2-vsvg的细胞，图1中C为表达P8-vsvg的细胞。二、P2介导膜融合功能的证明实验对在细胞表面表达了P2-vsvg或P8-vsvg的细胞进行了酸/碱处理。具体步骤如下所述-将步骤2)所述的方法表达后的重组杆状病毒S2或重组杆状病毒S8侵染后的Sf9细胞按照体积比1:100浓度接种到含有PH=6.2的T醒-ra培养基中在27°C条件下培养2天；将培养皿中的培养基吸净，加入lmlpH二5.0的PBS洗一次，吸净，再加入lmlpH=5.O的PBS，室温静置2ffiin，吸出PBS，用TNM-FH培养基(购自Invitrogen公司)洗一次，加入lml培养基静置。分别在Oh，4h和7h后分别取细胞在显微镜下观察。结果表明，当步骤2)所述的方法表达后的重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8或重组杆状病毒S2S8侵染的Sf9细胞在pH=6.2的培养基中生长时，都能够正常存活，没有异常现象的出现。在pH值为5.0环境下，发现重组杆状病毒S2侵染的细胞中Oh时细胞为正常表型，在4h时有部分细胞彼此粘连，形成多胞体，每个多胞体内有47个细胞，当7h后基本上所有细胞都形成了多胞体；在重组杆状病毒S8侵染的Sf9细胞一直没有多核体的出现(结果如图2所示，图2中A为S2侵染的细胞，图2中B为S8侵染的细胞)。同时用pH=8.0的PBS缓冲液对细胞进行了同样的处理，表达P2-vsvg或P8-vsvg的细胞均没有明显变化。三、P2介导膜融合功能的将重组杆状病毒S2、重组杆状病毒S8、或重组杆状病毒S2和重组杆状病毒S8共同稀释到滴度为2.5moi，分别按照步骤一中步骤4的方法侵染Sf9细胞，36h后按照步骤二所述的方法进行pH二5.0的酸处理。结果如图3所示，单独表达P2蛋白的细胞在4h后出现多核体，同时表达P2和P8的细胞在4h后也出现了多核体，结果没有发现P2的膜融合作用受到影响，表明，P8不会影响P2的膜融合作用。三、RDV侵染宿主细胞后可以导致多胞体现象发生将RDV粒子稀释至MOI=0.001，加入VCMs细胞，25°C温浴2h后移出病毒粒子，25°C培养3天和5天时取样，使用2%多聚甲醛固定，使用P8抗体进行了免疫荧光检测，结果如图4所示，结果表明，利用RDV病毒粒子侵染叶蝉VCM细胞，发现在3天的时候大量的细胞发生细胞融合现象形成多胞体。随着时间的增加，形成多胞体的细胞数目也在增加。这个结果表明，RDV侵染叶蝉细胞会导致细胞膜融合现象的发生。四、通过抑制细胞膜融合现象抑制水稻矮縮病毒侵染叶蝉针对步骤二中证明的P2这种依赖于低pH的膜融合功能，使用P-甲基环式胡精(methyl-P-cyclodextrin，P-MCD)对叶蝉VCM细胞进行处理，具体方法为在细胞培养基中加入120gH甲基环式胡精；以没有进行e-甲基环式胡精处理的细胞为对照；随后对上述进行了P-甲基环式胡精处理和没有进行0-甲基环式胡精处理的细胞(对照)分别进行免疫荧光检测，其中，一抗使用RDV抗体(以RDV病毒粒子为抗体，按照常规方法免疫小鼠得到的抗血清)，二抗使用FITC偶联的马抗鼠IgG(Sigma公司产品)。结果如图5所示，结果表明，P-MCD可以抑制细胞膜融合作用的发生，并且P-MCD处理的细胞感染RDV明显降低，大部分细胞中检测不到RDV的侵染，说明通过抑制细胞膜融合现象可抑制水稻矮縮病毒侵染，而没有进行处理的细胞仍然发生大面积细胞膜融合形成多核体。实施例2、抑制水稻矮缩病毒侵染的方法及其效果验证一、构建含有S2基因反向重复序列的水稻突变体日本晴野生型水稻购自RiceGenomeResourceCenter,NationalInstituteofAgrobiologicalSciences,J"即an。以曰本晴野生型水稻的愈伤组织为受体材料；以质粒pCAMBIA1301-IRS2为基因供体材料，该质粒含水稻矮縮病毒S2部分编码序列的反向重复序列、葡糖苷酸酶基因(GUS)和潮霉素抗性基因(HPT)。其中GUS基因为报告基因，可在底物存在下使转基因植物产生显色反应，HPT基因为选择标记基因，它赋予植物对潮霉素的抗性。具体操作步骤如下1、pCAMBIA1301-IRS2的构建设计水稻矮縮病毒S2部分片段(S2-l)及具有其反向重复序列的片段(S2-2)的扩增引物，序列如下F5:5'-ATTAATCGATATATGGCTTATCCTAATGACGT-3'("aI)R4:5'-AATTGTCGACAATGCATCATAGATAGA3'F6:5'-AGCAGGATCCATGTTAACATGAAAAATGTC3'(勘威I)R5:5'-AGCAAAAGCTTTGTTTTAGACTTAACTGGT3'(肠yIII)以水稻矮縮病毒的dsRNA基因组反转录得到的cDNA为模板，在引物F5和R4的引导下进行PCR扩增，将扩增产物测序表明，得到含67aI和&2I识别位点的S2基因S2-1(GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至540位核苷酸)。以水稻矮縮病毒的dsRNA基因组反转录得到的cDNA为模板，在引物F6和R5的引导下进行PCR扩增，将扩增产物测序表明，得到含&历〃I和ffi/7c/III识别位点的S2基因S2-2(S2-1的反向重复序列)。上述PCR反应条件均为先94。C，5分钟；55°C，40秒；72°C，1分钟30秒，共30个循环，然后72'CIO分钟。将PCR产物S2-1经67aI和5^7I酶切后插入pCAMBIA1301的67aI和5"WI酶切位点之间，经过在含50mg/L卡那霉素的LB抗性培养基上筛选阳性克隆，提质粒，将经测序表明反向插入了PCR产物S2-l的重组质粒载体命名为pCAMBIA1301-S2。将PCR产物S2-2经^3历#I和III酶切后插入pCAMBIA1301-S2的Ss/Z7v7I和酶切位点之间，经过在含50mg/L卡那霉素的LB抗性培养基上筛选阳性克隆，提质粒，将经测序表明反向插入了PCR产物S2-l和S2-2的重组质粒载体命名为pCAMBIA1301-IRS2。2、转pCAMBIA1301-IRS2水稻的获得1)将质粒pCAMBIA130卜IRS2转化入农杆菌菌株LBA4404中(农杆菌的菌株也可以是AGL-1等其它的菌株)；2)挑取经验证含有pCAMBIA1301-IRS2质粒的LBA4404农杆菌在液体LB培养基中，28t:振荡培养至对数生长期，取菌液涂布于含有10Oumol/L乙酰丁香酮的固体AB培养基上，28。C培养2天；3)将菌刮下来收集到含有10Oumol/L乙酰丁香酮的无菌水中，使农杆菌的浓度为5D(农杆菌的浓度在0.8-IOD范围内均可)；4)将日本晴野生型水稻愈伤组织在上述无菌水中浸泡半个小时后，取出用无菌滤纸吸干，接入含有100ixmol/L乙酰丁香酮的l/2MS培养基，共培养2天；5)将水稻愈伤组织转入含有30mg/L潮霉素和250mg/L头孢霉素的筛选培养基(MS培养基)上筛选培养；6)将步骤5)筛选得到的抗性愈伤组织转接入1/2MS分化培养基(MS培养基用水按体积别为l:l稀释)，诱导出苗和生根，得到转pCAMBIA1301-IRS2水稻植株。上述方法，共处理312块愈伤组织，结果得到62块抗性愈伤组织，转化效率达到20%，得到了62株转pCAMBIA1301-IRS2水稻再生苗，组织染色结果表明抗性愈伤组织及再生苗有GUS活性，说明pCAMBIA1301-IRS2质粒成功转入水稻。二、利用含有S2基因反向重复序列的水稻突变体抑制RDV感染将经饥饿处理的无毒叶蝉分别转移到感染RDV且发病明显的日本晴野生型(日本晴转基因组)或日本晴转基因水稻(野生型日本晴组)叶片上，饲毒48小时后，用毛笔轻轻触及叶蝉的腹管，待其口针从叶片中拔出后，分别转接到防虫温室内种植的无毒野生型日本晴水稻上，每种叶蝉各接毒水稻100株，每株5头，实验重复3次，接毒后7天，提取水稻总蛋白，利用水稻矮縮病毒P8蛋白抗体对水稻总蛋白进行Westernblot检测。Western结果阳性的为感病株，按照下式计算感病率感病率(％)=(感病株数/调查总株数)XIOO。结果如表1和表2所示，转基因样本组感病率为4%,明显低于野生型水稻的31%。说明转基因水稻抑制了RDVP2蛋白的表达，明显抑制了水稻矮縮病毒对叶蝉的侵染。表1.日本晴转基因组RDV病害情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2.野生型日本晴组RDV病害情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>权利要求1、一种抑制水稻矮缩病毒侵染的方法，是种植导入了选自水稻矮缩病毒P2蛋白的编码基因的部分片段和具有所述选自水稻矮缩病毒P2蛋白的编码基因的部分片段的反向重复序列的片段的水稻矮缩病毒宿主植物。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述P2蛋白的编码基因的核苷酸序列为GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至3461位核苷酸。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段的核苷酸序列为GenBankAccessionNumber为AY847464的自5'端第15位至540位核苷酸。4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段和具有所述选自水稻矮縮病毒P2蛋白的编码基因的部分片段的反向重复序列的片段是通过pCAMBIA1301转入所述水稻矮縮病毒宿主植物。5、根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于所述宿主植物为水稻。全文摘要本发明公开了一种抑制水稻矮缩病毒侵染昆虫的方法。该抑制水稻矮缩病毒侵染昆虫的方法，是抑制宿主细胞中的膜融合作用的发生；所述宿主细胞为水稻矮缩病毒能够侵染的宿主昆虫细胞或宿主植物细胞。本发明的方法可以有效的阻止病毒进入昆虫细胞开始其复制，对于病毒防治具有十分重要的意义。文档编号C12N15/82GK101200731SQ20071018736公开日2008年6月18日申请日期2007年11月23日优先权日2007年10月31日发明者锋周,毅李申请人:北京大学