专利名称：水稻品种抗黑条矮缩病室内接种鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性的室内接种鉴定方法及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
当严重影响长江下游稻区的水稻条纹叶枯病基本被控制之际，同为灰飞虱传播的另一种水稻病毒病——水稻黑条矮缩病又发生流行危害，该病害是由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)侵染水稻引发的，水稻一旦感病便无收获。据统计，2007年水稻黑条矮缩病仅在江苏省局部地区发生，危害面积30.8万亩，至2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地区蔓延开，全省发病面积上升至400万亩，其中仅病株率80％以上的绝收田块面积就达3万亩，按平均亩产500公斤初步估算约损失稻谷1.5亿公斤，造成了粮食减产、农民减收，给农业生产带来了巨大的损失，同时也严重挫伤了农民的种粮积极性。从植物病害流行学角度考察，水稻黑条矮缩病流行所需四大基本条件(丰富的毒源、大量的介体、大面积种植的感病品种和适宜的环境条件)已经具备，这与2001年水稻条纹叶枯病大爆发前夕所出现的征兆十分相似，可以预见江苏省乃至整个长江下游稻区水稻黑条矮缩病在未来一段时间内具有特大爆发流行的风险性，这将对全国的粮食安全构成巨大威胁。
面对具有突发性和爆发性特点的病毒病害，筛选抗病品种应用于生产是最为直接有效的方法，可是由于同由灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病与水稻黑条矮缩病共同发生流行，采用重病区田间鉴定时鉴定结果往往易受到水稻条纹叶枯病的干扰，这给水稻黑条矮缩病的品种抗性鉴定和评价增加了许多困难。这使得水稻黑条矮缩病的抗性品种选育工作受到极大的限制，迫切需要发明一种水稻黑条矮缩病的室内接种鉴定方法，既可以模拟田间的抗性鉴定效果，又可以避免田间鉴定时水稻条纹叶枯病的干扰，为水稻抗黑条矮缩病的资源发掘筛选、品种选育和遗传规律研究提供基本的研究手段。
发明内容
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病品种抗性的室内接种鉴定方法。
本发明的原理是采集携带水稻黑条矮缩病毒的植株饲喂灰飞虱使之获病并渡过病毒的循回期后获得接种体，再以一定数量的接种体在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平。
在上述方法中，“一定数量的接种体”是指有效接种虫量4-20头/株；“水稻特定生育期”是指水稻0.5-2.5叶龄；“接种待测水稻一定时间”是指接种水稻48-72小时。
所述用于饲毒的灰飞虱为1-3龄，饲毒时间为2-3天，饲毒后的循回期为10天以上(可根据操作需要、环境温度和带毒水稻植株的差异进行选择)。
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病抗性的室内接种鉴定方法，利用其评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平，既可以克服田间鉴定中因水稻条纹叶枯病同时发生给品种抗性评价带来的干扰，又可以拓宽品种抗性鉴定时间。这一鉴定方法可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
具体实施方法 实施例1，水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性的室内接种鉴定方法 ①携带水稻黑条矮缩病毒的植株的获得。
2009年5月于江苏邳州小麦重病区采集具有典型“绿矮”症状的小麦。参照Trizol(Reagent)说明书方法提取小麦总RNA。根据已发表的RBSDV的S9序列设计引物(引物由上海英俊生物技术公司合成) R5′-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3′ F15′-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3′。
采用RT-PCR检测确定病株是否携带水稻黑条矮缩病毒。反转录按照M-MLV反转录酶(Promega)说明书进行。PCR扩增体系为cDNA模板3.0μL，Taq plus酶0.5μL，dNTP(每份10mmol.L-1)0.5μL，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，5’端引物(10pmol.L-1)1.0μL，3’端引物(10pmol.L-1)1.0μL，ddH2O 16.5μL，合计25μL。反应程序为95℃预变性5min；94℃变性1min；51℃退火1min；72℃延伸1min；35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(1118bp)。同时采用斑点免疫结合法(DIBA)确定病株不携带水稻条纹病毒(RSV)。挑选出6株仅含有水稻黑条矮缩病毒的小麦植株备用。
②饲毒用灰飞虱的获得 2008年4-5月从江苏农科院小麦田中采集灰飞虱若虫，在感病品种武育粳3号上进行饲养，交配后单头雌虫单独产卵，随机抽取群体中10％的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测雌虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代，以后每代次随机抽取群体中10％的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测确保不带毒，即获得不携带RSV的灰飞虱。为避免传毒介体污染，每次饲毒前取100只DIBA法检测确定为无毒虫(不携带RSV的灰飞虱)。
③灰飞虱获得病毒 将筛选得到的病苗种于大烧杯中，土面覆盖滤纸，将适量1-2龄无毒若虫移入其中，并用纱布封口。饲毒2天后将虫移入烧杯(中饲养预先育有武育粳3号秧苗)，13天后每批随机取出30头灰飞虱，提取总RNA，方法如下取单头灰飞虱于2.0mL离心管，加300μL Trizol液摇动匀浆，室温下放置10min，加入70μL的氯仿，按住管盖剧烈摇荡15sec，室温放置2-3min，12000rpm离心15min，取上清液于一新离心管中，加入200μL的异丙醇(与上清等体积)，颠倒数次混匀；室温放置10min，12000rpm离心10min，弃去上清液，再加入1mL 75％酒精轻洗RNA沉淀，7500rpm离心5min，去上清，室温干燥5-10min，最后溶解在于10μL DEPC预处理的水中，保存于-20℃冰箱中。再采用①所述RT-PCR方法测定灰飞虱带毒率。
④接种强度对抗性鉴定的影响 接种强度按有效接种虫量(根据③中测定的灰飞虱带毒率换算，有效接种虫量＝接种虫量×带毒率)设置1、5、10、20头/株4个处理，重复3次。将感病品种华粳6号播于1000ml烧杯中，每杯播种30株苗。待秧苗长至1.5叶龄时进行接种鉴定(接种前2d淘汰病弱苗，挑选生长一致的幼苗25株用于接种鉴定)。接入灰飞虱后每天赶虫2次以确保被测水稻均匀获毒，接种2天后移走灰飞虱，将被测水稻移栽至大田，正常水肥管理。30天后开始病害调查，每4天调查一次，连续调查5次。症状主要表现为植株矮化，叶片短阔、僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上现初蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起。不同接种强度下水稻品种华粳6号的发病情况如表1。随着接虫强度的增加，华粳6号的发病率也不断提高，有效接种强度为5头/株、10头/株、20头/株3中处理间没有明显区别，但都显著高于1头/株处理。
表1
为明确室内接种鉴定时适宜的接种强度，进一步设置有效接种虫量为3、4、5头/株3个处理，接种及调查方法同上。发病结果如表2。有效接种强度为4头/株与5头/株发病率没有显著差异，但都显著高于1头/株与3头/株，这表明水稻黑条矮缩病室内接种鉴定适宜的有效接种强度应为4-20头/株。
表2
⑤水稻接种苗龄对抗性鉴定的影响 接种苗龄设置0.5、1.5、2.5、3.5叶龄4个处理，重复3次。接种强度为有效接种虫量5头/株，接种及调查方法同上。不同水稻接种龄期对水稻黑条矮缩抗性鉴定的影响如表3。当水稻接种龄期处于2.5叶龄之内时，华粳6号的发病率间不存在显著性差异，但当水稻接种龄期为3.5叶龄时与另外3种处理的鉴定结果间存在显著性差异，这表明水稻黑条矮缩病室内接种鉴定适宜的接种龄期应该为0.5-2.5叶龄。
表3
⑥接种时间对抗性鉴定的影响 接种时间设置12h、24h、48h和72h4个处理，重复3次。接种强度为有效接种虫量5头/株，接种苗龄为1.5叶龄，接种及调查方法同上。不同接种时间对水稻黑条矮缩抗性鉴定的影响如表4。随接虫时间的增加感病品种的发病率亦不断提高。接种72h和48h华粳6号的发病率显著高于另外2种处理，这表明水稻黑条矮缩病室内接种鉴定适宜的接种时间应该为48-72h。
表4
⑦室内接种鉴定与田间抗性鉴定效果的比较 以感病品种华粳6号为对象，采用④、⑤、⑥和⑦得出的水稻品种对黑条矮缩病室内接种鉴定适宜的接种条件进行鉴定(接种强度为有效接种强度5头/株，水稻接种苗龄期为1.5叶龄，接种时间为48h)，同时采用重病区田间鉴定方法在江苏省盐城市盐都区进行两品种的抗性鉴定，田间一代灰飞虱发生量峰期(当地灰飞虱传毒水稻黑条矮缩病的主要世代)调查虫量和带毒率，虫量折算为30头/株，随机采集1000头灰飞虱抽取100头以③述方法检测带毒率为15％，折算有效接种虫量为4.5头/株。田间鉴定于病害显症高峰期调查发病情况，调查标准同④。两种方法鉴定接种如表5(华粳6号对水稻条纹叶枯病的抗性较优且当地水稻条纹叶枯病的发生程度较轻，华粳6号水稻条纹叶枯病的平均发病率为2.5％，因此在计算水稻黑条矮缩病发病率时作为系统误差未予处理)。两种鉴定方法对华粳6号的鉴定结果间没有显著性差异，这表明本发明建立的室内接种鉴定方法可以有效模拟田间鉴定的效果。
表5
本发明主要服务于针对水稻黑条矮缩病开展的抗性资源筛选发掘、抗病品种的鉴定与评价和抗性品种的选育。同时该项技术还可在植物抗病性的遗传学和抗水稻黑条矮缩病毒转基因的研究工作中作为生物学检测方法应用，将能够大大加快研究的进程。
上述实施不以任何形式限定本发明。
权利要求
1.一种水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性的室内接种鉴定方法，其特征在于在室内条件下以一定数量的接种体在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平。
2.1中所述“一定数量的接种体”是指有效接种虫量4-20头/株；“水稻特定生育期”是指水稻0.5-2.5叶龄；“接种待测水稻一定时间”是指接种水稻48-72小时。
全文摘要
本发明提供了一种水稻黑条矮缩病品种抗性的室内接种鉴定方法。本发明的原理是在室内条件下以一定数量的接种体在水稻特定生育期接种待测水稻一定时间，培养待测水稻至发病显症后，根据病害发生的严重度评价待测水稻对水稻黑条矮缩病的抗性水平。利用本方法评价水稻品种对水稻黑条矮缩病的抗性水平，既可以克服田间鉴定中因水稻条纹叶枯病同时发生给品种抗性评价带来的干扰，又可以拓宽品种抗性鉴定时间。这一鉴定方法可以应用于水稻品种资源的发掘鉴定、品种抗性评价、抗病品种选育和抗性遗传规律研究等众多领域。
文档编号A01H1/04GK101816273SQ20101016423
公开日2010年9月1日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者周彤, 周益军, 吴丽娟, 程兆榜 申请人:江苏省农业科学院