专利名称：：水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用，属于农业科学
技术领域：
。
背景技术：
：当严重影响长江下游稻区的水稻条纹叶枯病基本被控制之际，同为灰飞虱传播的另一种水稻病毒病——水稻黑条矮缩病又发生流行危害，该病害是由水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)侵染水稻引发的，水稻一旦感病便无收获。据统计，2007年水稻黑条矮缩病仅在江苏省局部地区发生，危害面积30.8万亩，至2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地区蔓延开，全省发病面积上升至400万亩，其中仅病株率80%以上的绝收田块面积就达3万亩，按平均亩产500公斤初步估算约损失稻谷1.5亿公斤，造成了粮食减产、农民减收，给农业生产带来了巨大的损失，同时也严重挫伤了农民的种粮积极性。从植物病害流行学角度考察，水稻黑条矮缩病流行所需四大基本条件(丰富的毒源、大量的介体、大面积种植的感病品种和适宜的环境条件)已经具备，这与2001年水稻条纹叶枯病大爆发前夕所出现的征兆十分相似，可以预见江苏省乃至整个长江下游稻区水稻黑条矮缩病在未来一段时间内具有特大爆发流行的风险性，这将对全国的粮食安全构成巨大威胁。在同为RBSDV引发的玉米粗缩病的综合防治中，玉米对病害的成株期抗性的得到了很好的应用效果(采用调整播期方法使灰飞虱发生期避开玉米敏感期的农业措施已取得非常好的防治效果)，这启发我们在水稻黑条矮缩病的防治中同样可以利用寄主对病原的成株期抗性，来减轻病害造成的危害。
发明内容本发明提供了水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用方法。本发明的原理是在明确水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期的基础上，在敏感生育期内通过防治减少病原的侵染概率，而在非敏感生育期则主要利用水稻品种对病原的成株期抗性，以达到更少的防治投入获得更好防治效果的目的。在水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期内采用减少病原的侵染概率，而在非敏感生育期则主要利用水稻品种对病原的成株期抗性。在上述方法中，“水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期”是指水稻10叶龄之前；“物理、化学或栽培措施”是指秧苗期防虫网覆盖和适期防治灰飞虱等防治手段；“利用水稻品种对病原的成株期抗性”是指在非敏感生育期不采取针对病原的防治措施。本发明提供了水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用方法。运用该方法在水稻黑条矮缩病的防治中，能够以更少的防治投入获得更好防治效果。具体实施方法实施例1，水稻品种对水稻黑条矮缩病敏感生育期①携带水稻黑条矮缩病毒的植株的获得。2009年5月于江苏邳州小麦重病区采集具有典型“绿矮”症状的小麦。参照Trizol(Reagent)说明书方法提取小麦总RNA。根据已发表的RBSDV的S9序列设计引物(引物由上海英俊生物技术公司合成)R5'-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3‘Fl5'-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3‘。采用RT-PCR检测确定病株是否携带水稻黑条矮缩病毒。反转录按照M-MLV反转录酶(Promega)说明书进行。PCR扩增体系为cDNA模板3.OμL，Taqplus酶0.5yL，dNTP(每份10mmol.L-l)0.5yL，10XPCR缓冲液(含Mg2+)2.5μL，5，端引物(lOpmol.L-l)1.0yL，3，端引物(lOpmol.L-l)1.0μL,ddH2016.5μL，合计25μL。反应程序为95°C预变性5min；94°C变性Imin；51°C退火Imin；72°C延伸Imin；35个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的目的条带(1118bp)。同时采用斑点免疫结合法(DIBA)确定病株不携带水稻条纹病毒(Ricestripevirus,RSV)0挑选出6株仅含有水稻黑条矮缩病毒的小麦植株备用。②饲毒用灰飞虱的获得2008年4-5月从江苏农科院小麦田中采集灰飞虱若虫，在感病品种武育粳3号上进行饲养，交配后单头雌虫单独产卵，随机抽取群体中10%的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测雌虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代，以后每代次随机抽取群体中10%的灰飞虱采用斑点免疫结合法检测确保不带毒，即获得不携带RSV的灰飞虱。为避免传毒介体污染，每次饲毒前取100只DIBA法检测确定为无毒虫(不携带RSV的灰飞虱)。③灰飞虱获得病毒将筛选得到的病苗种于大烧杯中，土面覆盖滤纸，将适量1-2龄无毒若虫移入其中，并用纱布封口。饲毒2天后将虫移入烧杯(中饲养预先育有武育粳3号秧苗)，13天后每批随机取出30头灰飞虱，提取总RNA，方法如下取单头灰飞虱于2.OmL离心管，加300μLTrizol液摇动勻浆，室温下放置lOmin，加入70μL的氯仿，按住管盖剧烈摇荡15sec，室温放置2-3min，12000rpm离心15min，取上清液于一新离心管中，加入200μL的异丙醇(与上清等体积)，颠倒数次混勻；室温放置lOmin，12000rpm离心lOmin，弃去上清液，再加入ImL75%酒精轻洗RNA沉淀，7500rpm离心5min，去上清，室温干燥5-lOmin，最后溶解在于10μLDEPC预处理的水中，保存于-20°C冰箱中。再采用①所述RT-PCR方法测定灰飞虱带毒率。④水稻品种对水稻黑条矮缩病敏感生育期的确定以水稻品种特特普和感病品种华粳6号为研究对象，将供试品种分期播种于试验田育秧盘中，以便同时接种各个生育期水稻，待长至3-5叶龄后移栽于试验田中，正常水肥管理，获得叶龄期分别为2，4，6，8，10的健壮植株用于接虫试验(为保证秧苗不带毒，接虫前用无纺布罩于水稻苗上)。2-8叶龄的苗用两头开口玻璃管(直径8cm，高45cm)罩住，10叶龄的苗用铁圈支撑的纱网袋罩住，按8头/苗的有效接种虫量接入带毒灰飞虱(有效接种虫量=接种虫量X带毒率)，用尼龙纱布将玻璃管顶端封闭，48小时后向玻璃管及纱网袋内喷适当浓度的吡虫啉水溶剂灭虫，3小时后取走玻璃管，铁圈及纱网袋，每个处理5株苗，每个处理2个重复。正常水肥管理，30天后开始病害调查，每4天调查1次，直至完全显症。症状主要表现为植株矮化，叶片短阔、僵直，叶色深绿，叶背的叶脉和茎秆上初现蜡白色，后变褐色的短条瘤状隆起。不同叶龄期水稻接种RBSDV后发病情况如表1，结果表明在本研究的接种强度下感病品种华粳6号8叶龄以内是其对RBSDV最敏感的时期，发病率明显高于其他生育期。特特普6叶龄以内是其对RBSDV最敏感的时期，发病率也明显高于其他生育期。华粳6号与特特普10叶龄均没有发病。两个品种都呈现出随着接种叶龄增力口，对RBSDV敏感性降低的趋势。接种水稻完全显症后(2个月)，随机选取12株水稻采用RT-PCR方法进行检测，结果发现有典型发病症状的植株均能扩增到目的条带，无发病症状的植株均不能扩增到目的条带。上述结果表明水稻品种对水稻黑条矮缩病敏感生育期为水稻10叶龄以内。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2，水稻品种对水稻黑条矮缩病敏感生育期在减轻病害危害上的应用以水稻品种特特普和感病品种华粳6号为研究对象，将供试品种播种于试验田育秧盘中，3-5叶龄移栽，10叶龄前用无纺布罩于水稻苗上防止灰飞虱传播RBSDV。10叶龄时用铁圈支撑的纱网袋罩住，按8头/苗的有效接种虫量接入带毒灰飞虱，用尼龙纱布将玻璃管顶端封闭，48小时后向玻璃管及纱网袋内喷适当浓度的吡虫啉水溶剂灭虫，3小时后取走玻璃管，铁圈及纱网袋，每个处理5株苗，每个处理2个重复。正常水肥管理，30天后开始病害调查，每4天调查1次，直至完全显症。症状同实施例①。结果显示特特普和华粳6号均未表现出水稻黑条矮缩病的症状，随机选取3株水稻采用RT-PCR方法进行检测，均不能扩增到目的条带。这表明在水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期覆盖防虫网可以降低病害的发生和危害；而在非敏感生育期，较高的接种强度仍然不能使水稻发病，可以利用水稻自身的成株期抗性。本发明主要服务于水稻黑条矮缩病的防治，能够以更少的防治投入获得更好防治效果。上述实施不以任何形式限定本发明。权利要求水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用，其特征在于在水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期内采用物理、化学或栽培手段减少病原的侵染概率，而在非敏感生育期则主要利用水稻品种对病原的成株期抗性。2.1中所述“水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期”是指水稻10叶龄之前；“物理、化学或栽培措施”是指秧苗期防虫网覆盖和适期防治灰飞虱等防治手段。全文摘要本发明提供了水稻品种对黑条矮缩病的敏感生育期及其在减轻病害危害上的应用方法。在明确水稻品种对水稻黑条矮缩病的敏感生育期的基础上，在敏感生育期内通过防治减少病原的侵染概率，而在非敏感生育期则主要利用水稻品种对病原的成株期抗性，以达到更少的防治投入获得更好防治效果的目的。将本发明应用于水稻黑条矮缩病的防治，既可以节省防治成本，又可以提高防治效率，还可以减少过度化学防治带来的环境污染。文档编号A01G16/00GK101822188SQ201010164250公开日2010年9月8日申请日期2010年5月6日优先权日2010年5月6日发明者吴丽娟,周彤,周益军,程兆榜申请人:江苏省农业科学院