精子dna碎片检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括：包被载玻片，易熔凝胶，A液，B液，瑞氏染液，瑞氏缓冲液，SCD保存液。本发明还提供了应用上述试剂盒对精子DNA碎片的检测方法。本发明根据检测方法优化了试剂结构，使得试剂稳定、可靠，而且应用这些试剂进行检测时操作简单且无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广；本发明采用了独有的SCD保存液，可以有效的保存精液标本，其DNA碎片率在-20℃冻存两个星期内不发生变化，这样通过SCD保存液可以轻松保存所需的标本，不受时间和数量所限的进行检测，节省了大量的人力物力。
【专利说明】精子DNA碎片检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于体外检测试剂类，特别涉及精子DNA碎片检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]精子DNA的碎片程度反映了精子遗传物质的完整性。精子染色质扩散法是检测精子DNA碎片的主要方法之一。DNA完整的精子在经过变性和去掉核蛋白后DNA扩散形成特征性的光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生这种特征性的光晕，根据光晕的有无和大小判断精子的DNA完整程度。
[0003]目前，市面上已经有商家推出商业化的精子DNA碎片检测试剂盒，但大都存在一些问题，如:背景颜色太深、精子尾部不清晰、光晕太小导致判读困难等问题。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于提供一种方法学特异、结果易于判定、操作简单、易于临床推广应用的精子DNA碎片检测试剂盒。
[0005]本发明提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括:
[0006]包被载玻片，
[0007]易熔凝胶，
[0008]A 液，
[0009]B 液，
[0010]瑞氏染液，
[0011]瑞氏缓冲液，
[0012]SCD 保存液；
[0013]所述包被载玻片为包被有0.1~5%的熔点为20~60°C的琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.1~5%的熔点为20~60°C的琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.01%~0.5%氯化钠、0.1%~5%氨基乙酸、0.1%~1%冰醋酸、0.01%~0.5%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.1%~1% SDS、1%~10% Tris,0.1%~1%二水乙二胺四乙酸二钠、0.1%~1%吐温20且pH值为7.0~8.0的水溶液；所述瑞氏染液为含0.05~0.5%瑞氏色素、0.01~0.1 %吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.0~7.0的0.01~0.lmol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.1~I %氯化钠、40~80%吐温20的水溶液。
[0014]所述包被载玻片的制备方法为:
[0015]1)称取低熔点琼脂糖I~50g置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，50 ± 5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解；
[0016]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温；
[0017]3)趁热将步骤2)溶液置于载玻片表面铺平，烤干。
[0018]所述易熔凝胶的制备方法为:
[0019]I)称取琼脂糖I~50g置烧杯，置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，在水浴箱内50 ± 5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解；
[0020]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温2个小时；
[0021]3)趁热将步骤2)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
[0022]所述A液的制备方法为:
[0023]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠0.1~5g、氨基乙酸I~50g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
[0024]2)量取冰醋酸I~10ml、30%过氧化氢0.33~16.7ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
[0025]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0026]所述B液的制备方法为:
[0027]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDSl~10g、Trisl0~100g、二水乙二胺四乙酸二钠I~log、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0028]2)量取吐温201~10ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0029]3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.0~8.0。
[0030]4)以纯化水定容至1000ml。
[0031]所述瑞氏染液的制备方法为:
[0032]I)称取0.25~2.5g瑞氏色素、0.05~0.5g吉氏色素,置洁净烧杯中，加入5~20ml甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加5~20ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
[0033]2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
[0034]所述瑞氏缓冲液的制备方法为:
[0035]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠1.071~
10.712g、磷酸二氢钾1.107~11.067g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
[0036]2)用pH计检测溶液pH值，6.0~7.0为合格，偏酸用浓十二水磷酸氢二钠调校，偏碱用磷酸二氢钾调校；
[0037]3)以纯化水定容至1000ml。
[0038]所述S⑶保存液的制备方法为:
[0039]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠I~10g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
[0040]2)量取吐温20400~800ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；
[0041]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0042]所述精子DNA碎片检测试剂盒，优选包括:
[0043]包被载玻片，
[0044]易熔凝胶，
[0045]A 液，
[0046]B 液，
[0047]瑞氏染液，
[0048]瑞氏缓冲液，
[0049]SCD 保存液；
[0050]所述包被载玻片为包被有0.5%低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.25%琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.05%氯化钠、0.55%氨基乙酸、0.25%冰醋酸和0.045%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.25% SDS,2.422% Tris,0.125%二水乙二胺四乙酸二钠、0.15%吐温20且pH值为7.2~7.4的水溶液；所述瑞氏染液为含0.1%瑞氏色素、0.03%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.2~6.4的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.36%氯化钠、45%吐温20的水溶液。
[0051]所述的精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤:
[0052]1.试剂准备
[0053]I)将装有0.14ml易熔凝胶的样品管置于80°C孵育20分钟，待完全融化后，将易熔凝胶管置于37°C待用，至少平衡5分钟；
[0054]2)检测前将室温调整至20~28°C左右；
[0055]2.标本准备
[0056]I)以生理盐水调整液化的新鲜精子或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子浓度至 5 ~1X 106/ml ；
[0057]2)不能完成检测的新鲜标本，使用SCD保存液后冷冻保存，方法如下:在Eppendorf管中加入S⑶保存液300 μ I和待保存精液100 μ I，充分混匀，置于_20°C或-80°C保存，检测时 ，将其室温平衡后，以生理盐水调整精子浓度至5~10X106/ml ；
[0058]3.检测步骤
[0059]I)取已准备好的待测标本60 μ 1，加入上述易熔凝胶已熔化的样品管中，充分混匀，得到悬液，37°C孵育待用；
[0060]2)将包被载玻片置于2~8°C冰箱预冷5分钟后取出，迅速于载玻片包被区域加入步骤I)制备的悬液30 μ I ；
[0061]3)迅速盖上盖片，避免产生气泡；置2~8°C冰箱5分钟，使其凝固；
[0062]4)从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖片；
[0063]5)将载玻片立即垂直浸入盛有反应液A的反应池内，20~28V反应7分钟；
[0064]6)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体；将载玻片垂直浸入盛有反应液B的反应池内，20~28°C准确反应25分钟；
[0065]7)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体；将载玻片水平浸入大量的纯化水中5分钟，其间换水I~2次；
[0066]8)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体；将载玻片垂直浸入盛有70%乙醇的反应池内，2分钟；
[0067]9)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体；将载玻片垂直浸入盛有90%乙醇的反应池内，2分钟；
[0068]10)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体；将载玻片垂直浸入盛有100%乙醇的反应池内，2分钟；
[0069]11)空气中自然干燥；
[0070]12)每张载玻片以瑞氏染液15~20滴覆盖，等Imin后再缓慢地加入瑞氏缓冲液30~40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液，室温静置15min后以流水轻轻冲洗染片；
[0071]13)自然干燥或吹干；
[0072]14) 40 X显微镜下观察500个精子，计数存在DNA碎片的精子数量。
[0073]由于上述技术方案，本发明具有以下技术效果:
[0074]1、本发明根据检测方法优化了试剂结构，使得试剂稳定、可靠，而且应用这些试剂进行检测时操作简单且无需特殊检测仪器，便于临床常规应用与推广。
[0075]2、本发明采用了独有的SCD保存液，可以有效的保存精液标本，其DNA碎片率在_20°C冻存两个星期内不发生变化。这样通过SCD保存液可以轻松保存所需的标本，不受时间和数量所限的进行检测，节省了大量的人力物力。
【专利附图】
【附图说明】
图1为精子DNA碎片检测试剂盒检测的具体步骤4)中沿盖片下端向前轻轻推动盖片的示意图。
图2为精子DNA碎片检测试剂盒检测的具体步骤4)中捏住盖片的突出端且沿载玻片平面轻轻地抽走盖片的示意图。
【具体实施方式】
[0076]本发明提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括:
[0077]包被载玻片；
[0078]易熔凝胶；
[0079]A 液；
[0080]B 液；
[0081]瑞氏染液；
[0082]瑞氏缓冲液；
[0083]SCD 保存液。
[0084]所述包被载玻片为包被有0.1~5%低熔点(熔点为20~60°C )琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶(熔点为20~60°C )为含0.1~5%琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.01%~0.5%氯化钠、0.1%~5%氨基乙酸、0.1%~1%冰醋酸、0.01%~0.5%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.1%~1% SDS、1%~10% Tris,0.1%~1%二水乙二胺四乙酸二钠、0.1 %~I %吐温20且pH值为7.0~8.0的水溶液；所述瑞氏染液为含
0.05~0.5%瑞氏色素、0.01~0.1%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.0~
7.0的0.01~0.lmol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.1~I %氯化钠、40~80%吐温20的水溶液。现有的DNA碎片检测必须使用新鲜精液标本或液氮超低温保存的精液标本，当使用新鲜精液标本时，并不方便，检测时间也受到限制，消耗人力物力也比较多；而当采用液氮超低温保存时，保存的成本则太高。而本发明使用的SCD保存液能保存精液标本，其DNA碎片率在-20 1:冻存两个星期内不发生变化。这样通过S⑶保存液可以轻松保存所需的标本，不受时间和数量所限的进行检测，例如可以收集标本，几天检测一次，节省了大量的人力物力。
[0085]所述包被载玻片的制备方法为:
[0086]I)称取低熔点琼脂糖I~50g置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，50 ± 5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0087]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温。
[0088]3)趁热将步骤2)溶液置于载玻片表面铺平，烤干。
[0089]所述易熔凝胶的制备方法为:
[0090]I)称取琼脂糖I~50g置烧杯，置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，在水浴箱内50 ± 5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0091]2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50 ±5 °C水浴保温2个小时。
[0092]3)趁热将步骤2)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
[0093]所述A液的制备方法为:
[0094]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠0.1~5g、氨基乙酸I~50g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0095]2)量取冰醋酸I~10ml、30%过氧化氢0.33~16.7ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0096]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0097]所述B液的制备方法为:
[0098]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDS (十二烷基硫酸钠)I~10g、Tris(三羟甲基氨基甲烷)10~100g、二水乙二胺四乙酸二钠(厂家:广东光华化学厂有限公司，型号:250g/瓶)1~10g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0099]2)量取吐温201~10ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0100]3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.0~8.0。
[0101]4)以纯化水定容至1000ml。
[0102]所述瑞氏染液的制备方法为:
[0103]I)称取0.25~2.5g瑞氏色素、0.05~0.5g吉氏色素，置洁净烧杯中，加入5~20ml甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加5~20ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
[0104]2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
[0105]所述瑞氏缓冲液的制备方法为:
[0106]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠1.071~10.712g、磷酸二氢钾1.107~11.067g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0107]2)用pH计检测溶液pH值，6.0~7.0为合格，偏酸用浓十二水磷酸氢二钠调校，偏碱用磷酸二氢钾调校。
[0108]3)以纯化水定容至1000ml。
[0109]所述S⑶保存液的制备方法为:
[0110]I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠I~10g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0111]2)量取吐温20400~800ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0112]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0113]下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
[0114]实施例1
[0115]本实施例提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括:
[0116]包被载玻片；
[0117]易熔凝胶；
[0118]A液；
[0119]B液；
[0120]瑞氏染液；
[0121]瑞氏缓冲液；
[0122]SCD 保存液。
[0123]所述包被载玻片为包被有0.5%低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.25%琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.05%氯化钠、0.55%氨基乙酸、0.25%冰醋酸和0.045%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.25% SDS,2.422% Tris,0.125%二水乙二胺四乙酸二钠、0.15%吐温20且pH值为7.2~7.4的水溶液；所述瑞氏染液为含0.1%瑞氏色素、0.03%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.2~6.4的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.36%氯化钠、45%吐温20的水溶液。所述S⑶保存液可以保存精液标本，_20°C冻存两个星期内其DNA碎片率不会发生变化。
[0124]所述包被载玻片的制备方法为:
[0125]1)称取低熔点琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]5g置于能装下100ml的容器中，加纯化水100ml，50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0126]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温。
[0127]3)趁热将步骤2)溶液置于载片表面铺平，烤干。
[0128]所述易熔凝胶的制备方法为:
[0129]1)称取琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]2.5g置烧杯，置于能装下100ml的容器中，加纯化水100ml，在水浴箱内50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0130]2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50 ±5 °C水浴保温2个小时。
[0131]3)趁热将步骤5)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
[0132]所述A液的制备方法为:
[0133]1)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠0.5g、氨基乙酸5.5g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0134]2)量取冰醋酸2.5ml、30%过氧化氢1.5ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0135]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0136]所述B液的制备方法为:
[0137]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDS2.5g、Tris24.22g、二水乙二胺四乙酸二钠1.25g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0138]2)量取吐温201.5ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0139]3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.2~7.4。
[0140]4)以纯化水定容至1000ml。
[0141]所述瑞氏染液的制备方法为:
[0142]I)称取0.5g瑞氏色素、0.15g吉氏色素，置洁净烧杯中，加入1ml甲醇，研磨片亥|J，吸出上层染液；再加1ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
[0143]2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
[0144]所述瑞氏缓冲液的制备方法为:
[0145]I)取适量纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠3.213g、磷酸二氢钾3.320g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0146]2)用pH计检测溶液pH值，6.2~6.4为合格，偏酸用浓12水磷酸氢二钠调校，偏碱用磷酸二氢钾调校。
[0147]3)以纯化水定容至1000ml。
[0148]所述S⑶保存液的制备方法为:
[0149]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠3.6g，加入上述容量瓶中，
搅拌使其完全溶解。
[0150]2)量取吐温20450ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0151]3)以纯化水定容至1000ml,搅拌混匀。
[0152]实施例2
[0153]本实施例提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括:
[0154]包被载玻片；
[0155]易熔凝胶；
[0156]A液；
[0157]B液；
[0158]瑞氏染液；
[0159]瑞氏缓冲液；
[0160]SCD 保存液。
[0161]所述包被载玻片为包被有2%低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含I %琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.2%氯化钠、2.2%氨基乙酸、0.10%冰醋酸和
0.18%过氧化氢的水溶液；所述B液为含1%十二烷基硫酸钠(SDS)、10% Tris,0.5%二水乙二胺四乙酸二钠、0.6%吐温20且pH值为7.6~8.0的水溶液；所述瑞氏染液为含0.4%瑞氏色素、0.12%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.8~7.0的0.12mol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为1.44%氯化钠、75%吐温20的水溶液。所述S⑶保存液可以保存精液标本，_20°C冻存两个星期内其DNA碎片率不会发生变化。
[0162]所述包被载玻片的制备方法为:
[0163]I)称取低熔点琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]20g置于能装下100ml的容器中，加纯化水100ml，50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0164]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温。
[0165]3)趁热将步骤2)溶液置于载片表面铺平，烤干。
[0166]所述易熔凝胶的制备方法为:
[0167]I)称取琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]1g置烧杯，置于能装下100ml的容器中，加纯化水100ml，在水浴箱内50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0168]2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50 ±5 °C水浴保温2个小时。
[0169]3)趁热将步骤5)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
[0170]所述A液的制备方法为:
[0171]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠2g、氨基乙酸22g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0172]2)量取冰醋酸1.0ml、30%过氧化氢6.0ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0173]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0174]所述B液的制备方法为:
[0175]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDSlOg、TrislOOg,2水乙二胺四乙酸二钠5g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0176]2)量取吐温206.0ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0177]3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.6~8.0。
[0178]4)以纯化水定容至1000ml。
[0179]所述瑞氏染液的制备方法为:
[0180]I)称取2.0g瑞氏色素、0.6g吉氏色素，置洁净烧杯中，加入1ml甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加1ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
[0181]2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
[0182]所述瑞氏缓冲液的制备方法为:
[0183]I)取适量纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠12.854g、磷酸二氢钾13.28g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0184]2)用pH计检测溶液pH值，6.8~7.0为合格,偏酸用浓12水磷酸氢二钠调校,偏碱用磷酸二氢钾调校。
[0185]3)以纯化水定容至1000ml。
[0186]所述S⑶保存液的制备方法为:
[0187]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠14.4g，加入上述容量瓶中，
搅拌使其完全溶解。
[0188]2)量取吐温20750ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0189]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0190]实施例3
[0191]本实施例提供了一种精子DNA碎片检测试剂盒，包括:
[0192]包被载玻片；
[0193]易熔凝胶；
[0194]A液；
[0195]B液；
[0196]瑞氏染液；
[0197]瑞氏缓冲液；
[0198]SCD 保存液。
[0199]所述包被载玻片为包被有I %低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.5%琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.1 %氯化钠、1.1 %氨基乙酸、0.50%冰醋酸和0.09%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)、4.844% Tris,
0.2525% 二水乙二胺四乙酸二钠、0.3%吐温20且pH值为7.3~7.7的水溶液；所述瑞氏染液为含0.2%瑞氏色素、0.06%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.4~6.8的0.06mol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为0.72%氯化钠、65%吐温20的水溶液。所述SCD保存液可以保存精液标本，_20°C冻存两个星期内其DNA碎片率不会发生变化。
[0200]所述包被载玻片的制备方法为:
[0201]I)称取低熔点琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]1g置于能装下100ml的容器中，加纯化水100ml，50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0202]2)加纯化水定容到100ml，搅拌混匀，50 ± 5°C水浴保温。
[0203]3)趁热将步骤2)溶液置于载片表面铺平，烤干。
[0204]所述易熔凝胶的制备方法为:
[0205]I)称取琼脂糖[厂家:西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，型号:25g/瓶]5g置烧杯，置于能装下 100ml的容器中，加纯化水100ml，在水浴箱内50±5°C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解。
[0206]2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50 ±5 °C水浴保温2个小时。
[0207]3)趁热将步骤5)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
[0208]所述A液的制备方法为:
[0209]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠lg、氨基乙酸llg，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0210]2)量取冰醋酸5.0ml、30%过氧化氢3.0ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0211]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0212]所述B液的制备方法为:
[0213]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDS5g、Tris48.44g、2水乙二胺四乙酸二钠2.525g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0214]2)量取吐温203.0ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0215]3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.5±0.2。
[0216]4)以纯化水定容至1000ml。
[0217]所述瑞氏染液的制备方法为:
[0218]I)称取l.0g瑞氏色素、0.3g吉氏色素，置洁净烧杯中，加入1ml甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加1ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解；
[0219]2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
[0220]所述瑞氏缓冲液的制备方法为:
[0221]I)取适量纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠6.427g、磷酸二氢钾6.640g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0222]2)用pH计检测溶液pH值，6.4~6.8为合格，偏酸用浓12水磷酸氢二钠调校，偏碱用磷酸二氢钾调校。
[0223]3)以纯化水定容至1000ml。
[0224]所述S⑶保存液的制备方法为:
[0225]I)取10ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠7.2g，加入上述容量瓶中，
搅拌使其完全溶解。
[0226]2)量取吐温20650ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0227]3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
[0228]实施例4
[0229]本实施例提供了精子DNA碎片检测试剂盒检测的具体步骤如下:
[0230]1.试剂准备
[0231]I)将装有易熔凝胶的样品管(管中有0.14ml易熔凝胶)置于80°C孵育20分钟，待完全融化后，将易熔凝胶管置于37°C待用(至少平衡5分钟)。
[0232]2)检测前将室温调整至20~28°C左右。
[0233]2.标本准备
[0234]I)以生理盐水调整液化的新鲜精子(或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子)浓度至5~10 X 106/ml ο
[0235]2)不能完成检测的新鲜标本，可以使用SCD保存液后冷冻保存，可至少保存15天。方法如下:在Eppendorf管中加入S⑶保存液300 μ I和待保存精液100 μ 1，充分混匀，置于-20°C或_80°C保存。检测时，将其室温平衡后，以生理盐水调整精子浓度至5~10 X 16/ml ο
[0236]3.检测步骤
[0237]I)取已准备好的待测标本60μ1，加入上述易熔凝胶已熔化的样品管中(注意37°C持续保温)，充分混匀，得到悬液，37°C孵育待用。
[0238]2)将包被载玻片(规格为76.2X25.4mm)置于2~8°C冰箱预冷5分钟后取出，迅速于载玻片包被区域加入步骤I)制备的悬液30 μ I。
[0239]3)迅速盖上盖片，避免产生气泡；置2~8°C冰箱5分钟，使其凝固。
[0240]4)从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖片。方法:如图1所示，沿盖片下端向前轻轻推动盖片，直至盖片另一端稍稍超出载玻片宽度；捏住盖片的突出端，沿载玻片平面轻轻地抽走盖片，如图2所示。注意:在移动盖片的过程中，盖片始终紧贴于载玻片平面滑动，切不可将盖片向上抬离凝胶平面。
[0241]5)将载玻片立即垂直浸入盛有反应液A(A液)的反应池内，20~28°C反应7分钟。
[0242]6)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；将载玻片垂直浸入盛有反应液B (B液)的反应池内，20~28°C准确反应25分钟。
[0243]7)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；将载玻片水平浸入大量的纯化水中5分钟，其间换水I~2次。
[0244]8)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；将载玻片垂直浸入盛有70%乙醇的反应池内，2分钟。
[0245]9)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；将载玻片垂直浸入盛有90%乙醇的反应池内，2分钟。
[0246]10)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体(勿接触标本区)；将载玻片垂直浸入盛有100%乙醇的反应池内，2分钟；
[0247]11)空气中自然干燥。
[0248]12)染片。每张载玻片以瑞氏染液15~20滴覆盖，等Imin后再缓慢地加入瑞氏缓冲液30~40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液(注意勿破坏染液形成的表面张力)，室温静置15min后以流水轻轻冲洗染片。
[0249]13)自然干燥或吹干。
[0250]14) 40 X显微镜下观察500个精子，计数存在DNA碎片的精子数量。
[0251]4.结果观察与计算:
[0252]I)精子DNA碎片判定标准:精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。
【权利要求】
1.一种精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，包括: 包被载玻片， 易熔凝胶， A液， B液， 瑞氏染液， 瑞氏缓冲液， SCD保存液； 所述包被载玻片为包被有0.1~5%的熔点为20~60°C的琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.1~5%的熔点为20~60°C的琼脂糖的水溶液；所述A液为含.0.01%~0.5%氯化钠、0.1%~5%氨基乙酸、0.1%~1%冰醋酸、0.01%~0.5%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.1%~1% SDS、1%~10% Tris,0.1%~1%二水乙二胺四乙酸二钠、0.1%~1%吐温20且pH值为7.0~8.0的水溶液；所述瑞氏染液为含0.05~.0.5%瑞氏色素、0.01~0.1 %吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.0~7.0的.0.01~0.lmol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.1~I %氯化钠、40~80%吐温20的水溶液。
2.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述包被载玻片的制备方法为: . 1)称取低熔点琼脂糖I~50g置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，.50 ± 5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解； . 2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50±5 °C水浴保温； .3)趁热将步骤2)溶液置于载玻片表面铺平，烤干。
3.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述易熔凝胶的制备方法为: .1)称取琼脂糖I~50g置烧杯，置于能装下100ml的容器中，加入50~200ml纯化水，在水浴箱内50 ±5 °C水浴搅拌使琼脂糖完全溶解； . 2)加纯化水定容到1000ml，搅拌混匀，50±5 °C水浴保温2个小时； .3)趁热将步骤2)溶液分装于0.5ml样品管中，每管0.14ml。
4.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述A液的制备方法为: .1)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠0.1~5g、氨基乙酸I~.50g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解； . 2)量取冰醋酸I~10ml、30%过氧化氢0.33~16.7ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解； .3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
5.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述B液的制备方法为: I)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取SDSl~10g、TrislO~100g、二水乙二胺四乙酸二钠I~10g、加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。.2)量取吐温201~10ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解。 . 3)在pH检测下，缓缓加入浓盐酸，调节pH至7.0~8.0。 .4)以纯化水定容至1000ml。
6.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述瑞氏染液的制备方法为: .1)称取0.25~2.5g瑞氏色素、0.05~0.5g吉氏色素,置洁净烧杯中，加入5~20ml甲醇，研磨片刻，吸出上层染液；再加5~20ml甲醇，继续研磨，再吸出上液，如此连续几次，直到染粉全部溶解； .. 2)用甲醇定容到500ml，搅拌混匀，转移至棕色试剂瓶保存。
7.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述瑞氏缓冲液的制备方法为: 1)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取十二水磷酸氢二钠1.071~.10.712g、磷酸二氢钾1.107~11.067g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解； .2)用pH计检测溶液pH值，6.0~7.0为合格,偏酸用浓十二水磷酸氢二钠调校,偏碱用磷酸二氢钾调校； .3)以纯化水定容至1000ml。
8.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述SCD保存液的制备方法为: 1)取50~200ml纯化水置于100ml容量瓶中，称取氯化钠I~10g，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解； 2)量取吐温20400~800ml，加入上述容量瓶中，搅拌使其完全溶解；. 3)以纯化水定容至1000ml，搅拌混匀。
9.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述包被载玻片为包被有0.5%低熔点琼脂糖的水溶液的载玻片；所述易熔凝胶为含0.25%琼脂糖的水溶液；所述A液为含0.05%氯化钠、0.55%氨基乙酸、0.25%冰醋酸和0.045%过氧化氢的水溶液；所述B液为含0.25% SDS,2.422% Tris,0.125%二水乙二胺四乙酸二钠、0.15%吐温.20且pH值为7.2~7.4的水溶液；所述瑞氏染液为含0.1 %瑞氏色素、0.03%吉氏色素的甲醇溶液；所述瑞氏缓冲液为pH值6.2~6.4的0.03mol/L磷酸盐缓冲液；所述S⑶保存液为含0.36%氯化钠、45%吐温20的水溶液。
10.根据权利要求1所述的精子DNA碎片检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤:. 1.试剂准备 1)将装有0.14ml易熔凝胶的样品管置于80°C孵育20分钟，待完全融化后，将易熔凝胶管置于37°C待用，至少平衡5分钟；. 2)检测前将室温调整至20~28°C左右；. 2.标本准备 . 1)以生理盐水调整液化的新鲜精子或液氮冻存的精子或经提取后的活动精子浓度至.5 ~10 X106/ml ；. 2)不能完成检测的新鲜标本，使用SCD保存液后冷冻保存，方法如下:在Eppendorf管中加入S⑶保存液300 μ I和待保存精液100 μ 1，充分混匀，置于_20°C或_80°C保存，检测时，将其室温平衡后，以生理盐水调整精子浓度至5~1X 106/ml ；. 3.检测步骤 . 1)取已准备好的待测标本60μ1，加入上述易熔凝胶已熔化的样品管中，充分混匀，得到.悬液，37 °C孵育待用； .2)将包被载玻片置于2~8°C冰箱预冷5分钟后取出，迅速于载玻片包被区域加入步骤I)制备的悬液30 μ I ； .3)迅速盖上盖片，避免产生气泡；置2~8°C冰箱5分钟，使其凝固； . 4)从冰箱中取出载玻片，小心移去覆盖在上面的盖片； . 5)将载玻片立即垂直浸入盛有A液的反应池内，20~28°C反应7分钟； . 6)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有B液的反应池内，20~28 °C准确反应25分钟； .7)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片水平浸入大量的纯化水中5分钟，其间换水I~2次； . 8)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有.70%乙醇的反应池内，2分钟； .9)取出载玻片，用滤 纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有.90%乙醇的反应池内，2分钟； . 10)取出载玻片，用滤纸吸去残存于载玻片背面及侧缘的液体，将载玻片垂直浸入盛有.100%乙醇的反应池内，2分钟； .11)空气中自然干燥； . 12)每张载玻片以瑞氏染液15~20滴覆盖，等Imin后再缓慢地加入瑞氏缓冲液30~.40滴，以洗耳球轻轻吹打混合染液，室温静置15min后以流水轻轻冲洗染片； . 13)自然干燥或吹干； . 14)40 X显微镜下观察500个精子，计数存在DNA碎片的精子数量。
【文档编号】C12Q1/68GK104073555SQ201410203476
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】程浩, 陶思恩, 邓少君, 张翔, 庄学敏, 钟彩颜 申请人:深圳市博锐德生物科技有限公司