肺炎链球菌十三种荚膜多糖单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及肺炎链球菌十三种荚膜多糖单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体是分别以十三价肺炎链球菌结合疫苗中的十三种肺炎链球菌荚膜多糖为靶抗原，以十三价肺炎链球菌结合疫苗作为免疫原，免疫动物制备获得。所述单克隆抗体可特异识别1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F血清型的肺炎链球菌病原体。本发明提供的特异识别十三种血清型肺炎链球菌荚膜多糖的单克隆抗体分别与其它十二型荚膜多糖无明显交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中各型多糖组分的水平，在临床检测和疫苗生产的质检环节中将得到广泛应用。
【专利说明】肺炎链球菌十三种荚膜多糖单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域及抗体制备技术，具体地说，涉及肺炎链球菌十三种荚膜 多糖单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)可以引发肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症 和败血症等多种疾病，是引起全世界范围内婴幼儿、老年人和免疫缺陷个体疾病的主要病 原菌，5岁以下小儿和60岁以上老人普遍易感。作为儿科常见病的肺炎，每年可导致约140 万儿童死亡（其中99%的死亡发生在发展中国家），是儿童死亡的第一病因。
[0003] 肺炎链球菌是革兰氏阳性、带荚膜的双球菌，链球菌属。存在于荚膜中的荚膜多糖 为肺炎链球菌重要的致病因子，由大量多聚体组成，能帮助入侵寄主的免疫系统。肺炎链球 菌可以在5-10%的健康成人及20-40%孩童的鼻咽内发现。它利用表面黏着素与上皮细胞 的相互作用，紧贴在鼻咽细胞上。肺炎链球菌可直接通过密切接触，经呼吸道飞沫进行人际 传播。若将肺炎链球菌吸入肺部而不能清理，加上病毒感染或吸烟引发的纤毛痳痹，就会造 成肺炎。一旦肺炎链球菌进入一些很难发现的地方，它就会活性化补体蛋白质，刺激细胞激 素的生成及吸引白血球（尤其是嗜中性白血球）。它的多糖荚膜会抵抗吞噬作用，若并没有 抗荚膜的抗体，肺泡巨噬细胞则不能有效地杀死它们。若它们扩散至血液中，就可能会引发 菌血症，并且被带到身体的其他地方，如脑膜、关节、骨骼及腹膜，亦可能会导致脑膜炎、脑 脓肿、骨髓炎或脓毒性关节炎等。
[0004] 根据肺炎链球菌荚膜多糖的组成差异，分为91个肺炎链球菌血清型，各血清型均 有其独特的多糖荚膜。血清型是以两种系统来编号，源自美国的系统是按照其发现的先后 次序来编号，而源自丹麦的系统则是以抗原的相似性来编号。不同年龄、时间和地域的血清 型分布谱也有所不同，但全球常见的致病血清型是一致的。在全球范围，肺炎链球菌对常用 抗菌药物（如青霉素、头孢霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑、大环内酯类和氯霉素）产生耐药性 已成为一个日益严重的问题，这使得特异性治疗更加复杂，也凸显了接种疫苗预防肺炎链 球菌疾病的重要性。目前临床用肺炎链球菌疫苗主要有三种：包含7种血清型（4、6B、9V、 14、18C、19F和23F)的七价肺炎链球菌疫苗；包含十三种血清型（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、 14、18C、19A、19F和23F)的十三价肺炎链球菌疫苗和包含23种血清型（1、2、3、4、5、6B、7F、 8、9N、9V、10A、11A、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F)的二十三价肺炎链球菌 疫苗。
[0005] 目前对肺炎链球菌血清分型的鉴定方法，大多数临床微生物学实验室是通过肺炎 链球菌培养进行实验室诊断，但如果在采集标本前进行过抗生素治疗，或者处理或运输标 本不当以及使用不合适的培养基都可能导致分离失败。因此亟待开发一种快速鉴别诊断肺 炎链球菌各血清分型的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供肺炎链球菌十三种荚膜多糖单克隆抗体及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种单克隆抗体，分别以十三价肺炎链球 菌结合疫苗中的十三种肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖为祀抗原，以 十三价肺炎链球菌结合疫苗作为免疫原，免疫动物（如小鼠）制备获得。其中，十三种肺炎 链球菌荚膜多糖的血清型分别为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F ;所述十三 价肺炎链球菌结合疫苗是由上述十三种不同血清型的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白共 价连接形成的。
[0008] 所述单克隆抗体能够特异性地识别1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或 23F血清型的肺炎链球菌病原体和载体蛋白。
[0009] 前述的载体蛋白为白喉毒素 CRM197蛋白或破伤风类毒素 TT蛋白等本领域常用的 载体蛋白。
[0010] 具体地，以十三价肺炎链球菌结合疫苗作为免疫原免疫小鼠，采用杂交瘤技术经 过细胞融合，筛选得到能持续、稳定分泌抗肺炎链球菌十三种荚膜多糖和载体蛋白的单克 隆抗体的杂交瘤细胞株，由各细胞株分泌得到几十种单克隆抗体。
[0011] 所述单克隆抗体选自 Tl、T3、T4、T5、T6A、T6B、T7F、T9V、T14、T18C、T19A、T19F 或 T23F中的任一种，它们的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1-26所 /_J、1 ο
[0012] 由十三价肺炎链球菌结合疫苗作为免疫原制备得到的几十种单克隆抗体能够分 别特异性地识别十三种肺炎链球菌荚膜多糖，每种血清型各获得数种单克隆抗体，每种载 体蛋白各获得数种特异的单克隆抗体。
[0013] 每种血清型各自获得的单克隆抗体具有良好的特异性，实验表明，每种血清型的 单克隆抗体与其它十二种荚膜多糖抗原没有显著的交叉反应，间接ELISA表明这些抗体具 有较高的效价，因此可用于肺炎链球菌十三种血清型荚膜多糖的检测。可以采用双抗夹心 法，分别利用各自单克隆抗体作为包被抗体和检测抗体，对各型荚膜多糖进行检测。
[0014] 本发明还提供分泌产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0015] 本发明还提供含有上述单克隆抗体的检测试剂盒。
[0016] 所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒，其以特异性地识别1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、 14、18C、19A、19F或23F血清型肺炎链球菌的单克隆抗体为包被抗体，以酶标记的单克隆抗 体作为检测抗体。
[0017] 所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒，其以特异性地识别载体蛋白的单克隆抗体 为包被抗体，以酶标记的特异性地识别1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F血清 型肺炎链球菌的单克隆抗体作为检测抗体。
[0018] 本发明进一步提供所述单克隆抗体或检测试剂盒在检测十三种血清型（1、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)肺炎链球菌荚膜多糖中的应用。
[0019] 本发明提供的特异识别十三种血清型（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 或23F)肺炎链球菌荚膜多糖的单克隆抗体分别与其它十二型荚膜多糖无明显交叉反应， 用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中各型多糖组分的水平，在临 床检测和疫苗生产的质检环节中将会得到广泛应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为本发明制备的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图。
[0021] 图2为本发明制备的单克隆抗体T19F的特异性检测结果。
[0022] 图3为本发明制备的单克隆抗体的亚型鉴定图。
[0023] 图4为本发明利用ELISA法检测试剂盒灵敏度实验的拟合曲线。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0025] 实施例1杂交瘤细胞系的建立
[0026] 一、实验材料
[0027] 1、免疫原：本实施例分别以十三价肺炎链球菌结合疫苗中的十三种（1、3、4、5、 6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F)血清型肺炎链球菌荚膜多糖为靶抗原，十三价肺炎链 球菌结合疫苗作为免疫原。
[0028] 2、培养基：DMEM培养基购自Hyclone公司；HAT、HT选择培养基以及降植烷购自 Sigma公司。
[0029] 3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
[0030] 4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自Sigma公司；PEG4000购自 Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠 IgG抗体（即辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG抗体） 购自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；其余试剂均为国产分析纯产品。
[0031] 二、杂交瘤细胞系的建立
[0032] 1、动物免疫
[0033] 1)基础免疫：将抗原（即十三价肺炎链球菌结合疫苗）与福氏完全佐剂等体积混 合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100 μ g。
[0034] 2)加强免疫：加强免疫采用抗原（即十三价肺炎链球菌结合疫苗）与福氏不完全 佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150 μ g抗原的生理盐水溶液。
[0035] 2、杂交瘤细胞的制备
[0036] 按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的 PEG4000 (聚乙二醇4000)进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10-15天，取上清采用 间接ELISA法筛选分泌抗每种多糖型和载体蛋白的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用 有限稀释法进行亚克隆。
[0037] 间接ELISA法的操作步骤如下：用200yL的各型多糖（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、 14、18C、19A、19F、23F)和载体蛋白（白喉毒素 CRM197蛋白）分别包板，用免疫小鼠血清 1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加 1:2000HRP-山羊抗小鼠 IgGlOOyL，最后测定450nm处的0D值。0045。值大于阴性对照2倍 以上的，可初步判定为阳性克隆。
[0038] 3、杂交瘤细胞系的建立
[0039] 重复步骤2,进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到三十株分 别针对各型多糖的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
[0040] 4、上述杂交瘤细胞系分泌产生的单克隆抗体的效价检测
[0041] 1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价 为：1 :50000-1 :100000。
[0042] 2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1 : 500000-1 :1000000。
[0043] 5、杂交瘤细胞系的传代培养
[0044] 将上述杂交瘤细胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代， 培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达 至IJ 1:10000 以上。
[0045] 以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗十三种血 清型（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F)肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的 单克隆抗体。
[0046] 获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否 则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体 的特性。另外在长期培养过程中，难免发生污染或灭失，因此须冷藏保存一部分杂交瘤细 胞。保存方法如下：
[0047] 1.材料
[0048] (1)细胞：取对数生长期的细胞。
[0049] (2) 10%二甲基亚砜保护液（二甲基亚砜可损坏滤器，又易被高压破坏，因此不能 过滤或高压消毒，其本身为有毒的化学品，无菌）：含10%二甲基亚砜、20%灭活胎牛血清， 70% RPMI-1640 液。
[0050] (3)20% FCS-1640 培养液：含青霉素 100U/mL，链霉素 100μ g/mL。
[0051] (4)灭菌的2mL安瓶等。
[0052] 2.操作方法
[0053] (1)去掉细胞培养瓶中的旧培养液，加入10% FCS-1640液悬浮细胞。
[0054] (2) 10001'/11^11离心101^11，去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成 1. 0X107个细胞/mL的悬液。
[0055] (3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95%以上。
[0056] (4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0· 5-1. OmL，熔封安瓶。
[0057] (5)置于 4°C 2h。
[0058] (6)置于液氮罐的气态部分（_70°C ) 15h。
[0059] (7)转入液氮中保存。
[0060] 实施例2抗十三种肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的单克隆抗体的制备
[0061] 一、抗体制备
[0062] 选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烧，每只小鼠0. 5mL。7-10天后腹腔接种第 16代杂交瘤细胞，每只小鼠接种IX 106?2X 106个细胞。间隔5天后，待腹部明显膨大， 以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
[0063] 将腹水以13000r/min离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。 用Protein G-S印harose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为： ρΗ2· 7,20mM 的甘氨酸缓冲液，分别得到抗十三种（1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 或23F)血清型肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白的单克隆抗体。
[0064] 二、抗体的鉴定
[0065] 1、抗体纯度鉴定
[0066] SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95%以上。（图1)
[0067] 2、抗体的特异性鉴定
[0068] 采用间接ELISA法，检测获得的各株单抗针对十三种肺炎链球菌荚膜多糖的特异 性。单抗T19F的特异性检测结果如图2所示。
[0069] 3、抗体类及亚类鉴定
[0070] 采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗 体的Ig亚型。（图3)
[0071] 4、抗体浊度检测
[0072] 按一定比例将抗原、抗体和乳胶颗粒结合物混合，37°C反应5-30分钟后用日立 7180型自动生化分析仪分析。结果见表1。
[0073] 表1抗体浊度检测结果
[0074]
【权利要求】
1. 单克隆抗体，其特征在于，分别以十三价肺炎链球菌结合疫苗中的十三种肺炎链球 菌（Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖为祀抗原，以十三价肺炎链球菌结合疫苗作为免 疫原，免疫动物制备获得； 其中，十三种肺炎链球菌荚膜多糖的血清型分别为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、 19A、19F和23F ;所述十三价肺炎链球菌结合疫苗是由上述十三种不同血清型的肺炎链球 菌荚膜多糖和载体蛋白共价连接形成的； 所述单克隆抗体特异性地识别1、3、4、5、6八、68、7?、听、14、18(：、194、19?或23?血清型 的肺炎链球菌病原体和载体蛋白。
2. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述载体蛋白为白喉毒素 CRM197 蛋白或破伤风类毒素 TT蛋白。
3. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，免疫使用的动物为小鼠。
4. 根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体选自ΤΙ、T3、T4、 T5、T6A、T6B、T7F、T9V、T14、T18C、T19A、T19F或T23F中的任一种，它们的轻链可变区和重 链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1-26所示。
5. 产生权利要求1-4任一项所述单克隆抗体的杂交瘤细胞。
6. 含有权利要求1-4任一项所述单克隆抗体的检测试剂盒。
7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，其为ELISA检测试剂盒，其以特异 性地识别1、3、4、5、6八、68、7?、听、14、18(：、194、19?或23?血清型肺炎链球菌的单克隆抗体 为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体作为检测抗体。
8. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，其为ELISA检测试剂盒，其以特 异性地识别载体蛋白的单克隆抗体为包被抗体，以酶标记的特异性地识别1、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、14、18C、19A、19F或23F血清型肺炎链球菌的单克隆抗体作为检测抗体。
9. 权利要求1-4任一项所述单克隆抗体或权利要求6-8任一项所述检测试剂盒在检测 十三种肺炎链球菌荚膜多糖中的应用。
【文档编号】C12R1/91GK104151426SQ201410203694
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】孙乐, 张翠娟, 王炜, 孙哲, 樊贵宝, 张小刚 申请人:北京天成新脉生物技术有限公司