TGATATTGTACCGTATTGTATTGT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
[00化]SEQ ID NO.IO
[0066] 氨基酸序列
[0067] 〉NtMT5p;rotein [006引 MNSNNTTDQKIPKRPKPGGNIFGKACKICPCKYQICSKCPKCDDQNIAGKFCKICSCKTQICSKCPKCHNQN
[0069] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可WW许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供运些实施例的目的是使对本 发明公开内容的理解更加透彻全面。
[0070] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0071] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0072] 实施例1:五个烟草金属硫蛋白基因在烟草体内受重金属Cd诱导表达的检测，同时 也受到莱莉酸和甘露醇的调控
[0073] 本发明首先采用烟草幼苗检测运5个烟草金属硫蛋白的表达特征。本发明中所用 的烟草品种为红花烟草SRUNicotiana tabacum L.CV.SR1)，种子由中科院华南植物园保 存提供。采用1/^2液体15培养基萌发烟草种子，两周后长成小苗，将烟草幼苗转移1/215液体 培养基继续培养2周。然后分别用含有CdCl2(50yM)、JA(90yM)和甘露醇（300mM)的1/2MS液 体培养基处理烟草幼苗，收集胁迫处理化、6h和24h后的烟草幼叶和幼根各0.2g，用于提取 总RNAdRNA的提取依照Magen公司化化re Plant RNA Kits(R4151)的说明书进行。采用两步 法W总RNA为模板逆转录cDNA。cDNA链的合成依照全式金公司TransScript One-Step曲NA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。
[0074] 通过网站NCBKhttp://www.dtd.nlm.n;?h.gov/)在线设计real-timeRT-PCR引 物。引物序列如下所示。
[0075] NtMTlRTF:5'-CGGAGGATGTGGGATGTACC-3'和 NtMTlRTR:5'-口764了01^：4口76〔460：-3'用于检测化]\0'1基因的表达量；（沈9 10^.11、沈9 10^.12)
[0076] NtMT2RTF:5'-GTGGGATGTACCCCGACTTG-3'和 NtMT2RTR:5'-八1^46〔46176〔446661^4-3'用于检测化]\〇'2基因的表达量；（沈9 10^.13、沈9 10^.14)
[0077] NtMT3RTF:5'-CACAACCGAGACTTTGGTGC-3'和 NtMT3RTR:5'- 66667^〔4口76〔461^464-3'用于检测化]\〇'3基因的表达量；（沈9 10^.15、沈9 10^.16)
[0078] NtMT4RTF:5'-TCATTCAGGGTGTTGCTCCC-3'和 NtMT4RTR:5'-八6八4446〇：4〔61^4〔4〔64-3'用于检测化]\〇'4基因的表达量；（沈9 10^.17、沈9 10^.18)
[0079] NtMT5RTF:5'-ACGTCTAAGGCAACTGCTCC-3'和 NtMT4RTR:5'-了601^^1；4了4口'17661^4-3'用于检测化]\0'5基因的表达量；（沈9 10^.19、沈9 10^.20)
[0080] 选用的烟草内参基因为烟草核糖体蛋白基因化EF-la/化L25(NCBI Accession number:L18908)，引物如下：N化25F(5'-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3'）和化L25R(5'-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3'）e(WQIDN0.21、WQIDN0.22)
[0081 ]参考BIO-RAD公司Universal SYBR Green Supermix的说明书配制real time RT- PCR反应体系(冰上操作）。采用两步法PCR反应，扩增标准程序如下：
[0082]
[0083] 所有检测均采用两个生物学样本重复，每个生物学样本进行Ξ次重复检测反应。 引物第一次使用时添加程序Stage3检测溶解曲线，确认引物的特异性。
[0084] 如图1所示，在Cd胁迫处理下，在烟草幼苗中，五个烟草金属硫蛋白基因的表达都 受到重金属Cd胁迫的诱导，在根中的诱导较为明显;五个烟草金属硫蛋白基因的表达也受 到莱莉酸JA和高渗透压甘露醇的诱导。
[0085] W上公开的内容表明了运五个烟草金属硫蛋白基因是一类广泛的重金属儒胁迫 应答基因，参与烟草体内重金属儒解毒。该类基因具备应用于针对重金属儒胁迫和富集的 烟草和其他作物遗传工程改良的潜力，也可作为相应正对重金属污染上壤植物修复基因工 程的备选功能基因。
[0086] 实施例2:5个烟草金属硫蛋白基因的克隆和酵母重组表达载体的构建
[0087] 取烟草SR1 (华南植物园保存）的幼苗叶片，提取幼叶的RNA，并逆转录成cDNA，W cDNA为模板，设计引物化MT1YEF: 5 ' -TTTCAGGGCGCCATGTCTTGTTGCGGAGGAAGTTG-3 ' 和 NtMTlYER:5'-CGTTACTAGTGGATCTTAACAATTGCAAGGGTCAC-3'（SEQ ID N0.23、SEQ ID NO. 24)，用于扩增化MTl的cDNA阅读框，并获得25化p的DM片段；
[008 引 设计引物化 MT2YEF: 5 ' -TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCTGTGGAGGAAGCTG-3 ' 和化 MT2YER: 5'-〔67^押46了6641'(：1^46〔46176〔446661^4(：-3'（569 10側.25、沈9 10側.26)，用于扩增 化MT2的cDNA阅读框，并获得25化P的DNA片段；
[0089] 设计引物化 MT3YEF: 5 ' -TTTCAGGGCGCCATGTCTTGCTGTGGAGGAAACTG-3 ' 和化 MT3YER: 5'-〔67^押46了6641'(：7^6〇：44了44466〔444〔4-3'（沈9 10側.27、沈9 10側.28)，用于扩增 化MT3的cDNA阅读框，并获得324bp的DNA片段；
[0090] 设计引物NtMT4YEF : 5 ' -TTTCAGGGCGCCATGTCTGGCTGCGGATCAAACTG-3 ' 和Nt MT4YER:5'-CGTTACTAGTGGATCTTMCAGTTGCAAGGGTCAC-3'，（WQIDN0.29、SEQIDN0.30) 用于扩增化MT4的cDNA阅读框，并获得249bp的DM片段；
[0091 ]设计引物NtMT5YEF : 5 ' -TTTCAGGGCGCCATGAATTCAAACAACACTACTGA-3 ' 和Nt MT5Y邸：5'-CGTTACTAGTGGATCCTAATTTTGGTTATGACATT-3'（沈Q ID N0.3USEQ ID N0.32)， 用于扩增化MT5的cDNA阅读框，并获得24化p的DM片段。
[0092] 上述扩增获得的DNA片段依照Magen公司化化re Gel Pure DNA Kits说明书进行 琼脂糖凝胶电泳回收。回收得到的片段用于插入至酵母表达载体PYES60中。酿酒酵母表达 载体P YES260经Ncol和BamHI双酶切处理，回收线性化质粒。回收后的五个烟草金属硫蛋白 cD NA阅读框片段和线性化PYES260质粒经Nano化op公司紫外分光光度计测定浓度，采用化 KaRa(Clontech)公司的In-Fusion'、？皿Cloning Kit进行DNA片段和载体的同源重组连接。 按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌JM109感受态菌株。挑取单克隆，提取质粒，经 测序鉴定为正确的阳性克隆后，保存质粒备用。经测序分析鉴定其正确性。构建好的五个烟 草金属硫蛋白今酿酒酵母重组表达载体如图2所示。
[0093] 实施例3:五个烟草金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的表达提高酵母对重金属儒的 耐受性
[0094] 培养酿酒酵母菌株野生型WT和儒敏感突变株Aycfl (购自欧洲酵母研究中屯、 Euroscarf, http : //web. uni-frankfurt. de/fbl5/mikro/euroscarf/,菌株编号分另。为 YOOOOO和Y04069)，用pYE S260质粒和重组的五个含有烟草金属硫蛋白的PYES260质粒(如 图2所示)对上述酵母进行转化。由于插入的外源烟草金属硫蛋白基因是置于酵母半乳糖诱 导的启动子PGAL1调控之下(见图2所示），将转化获得的酿酒酵母单克隆置于添加半乳糖的 生长选择合成培养基（Sel ective Growth Synthetic Medium,SD medium)上生长，即可诱 导外源的烟草金属硫蛋白基因在酵母中异源超量表达。
[00M]酵母转化采用的方法为醋酸裡转化法，具体步骤如下：
[009