6] 1)接种待转化的酵母菌株WT和Δ yen的单菌落于5mL YPD液体培养基中，于30°C 恒溫摇床(200巧m)，培养过夜达到饱和。
[0097] 2)按照1: 100比例转移上述培养物到20mL YPD液体培养基中于30°C恒溫摇床 (20化pm)继续培养，摇3-化至菌液0〇6日日值达0.5。
[0098] 3)培养液在室溫条件下4000g离屯、5min，收集细胞。细胞用lOmL无菌超纯水重悬， 再于室溫下5000-6000g离屯、5min，沉淀细胞。
[0099] 4)细胞用2mL裡盐溶液（1XTE缓冲液，pH 7.5;1X乙酸裡)重悬。
[0100] 5)将化L待转化质粒和10化变性娃鱼精一起加入1.5mL离屯、管中混匀。
[0101] 6)往每个离屯、管中加入20化L用裡盐溶液重悬的细胞悬液，再加入ImL新鲜配制的 阳G溶液(40 % PEG; 1 X TE缓冲液，pH 7.5; 1 X乙酸裡）。30°C摇荡溫育30min。
[0102] 7)于42°C热激15min，室溫下离屯、5s，细胞沉淀用200yklmL 1XTE缓冲液(从10X 储液新鲜配制）重悬，并取其中2(Κ)化涂布在添加了半乳糖的SD固体培养基平板上。30°C培 养2-5天，直到出现转化子。
[0103] 挑取酵母菌株WT和Δ yen转化空载体PYES260和4个烟草金属硫蛋白基因超表达 载体（0sMT-I-la-pYES260,0sMT-I-2a-pYES260,0sMT-I-3a-pYES260 和 0sMT-I-4c-PYES260)的单克隆，接种于2ml添加了半乳糖的S的夜体培养基中，30°C恒溫摇床(200巧m)培 养至菌液ODsqq值达2。按照1:1、1:10、1:100、1:1000将菌液进行逐级稀释，分别吸取化1逐级 稀释的菌液滴至添加有0. 〇75mM Cd的SD(添加半乳糖）固体培养基平板上。30°C培养7天，观 察酵母生长情况。
[0104] 如图3所示，超表达五个烟草金属硫蛋白基因的转基因酵母相比较于转化空载体 PYES260的Aycfl酵母突变株而言，能够在添加 0.075mM Cd的SD培养基平板中生长，而未表 达外源基因的A yen酵母菌株(转化空载体PYES260)则不能生长，表明本发明公布的五个 烟草金属硫蛋白基因在酵母中的表达能够提高酵母对重金属儒的耐受性。
[0105] 实施例4:五个烟草金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的表达提高酵母体内儒的积累
[0106] 取实施例3中分别转化空载体PYES260和含有五个烟草金属硫蛋白基因重组载体 PYES260 (如图2所示)酵母菌株野生型WT和Δ y cfl，在超净台中用无菌牙签挑取十二种酵母 转化子（酵母菌株野生型WT和Δ yen分别转化PYES260和五个烟草金属硫蛋白重组载体 pYES260)到2mL添加了半乳糖的生长选择合成培养基（Selective Growth Synthetic Medium，SD medi um)液体培养基中，30°C恒溫摇床(200巧m)培养至菌液0〇6日日值达2。之后将 十二种酵母按照1:500的体积比接种于600ml添加了半乳糖的SD液体培养基中，30°C摇床 (200-250巧m)培养约12小时至0〇6日日值达2,之后分别添加 CdCl2至终浓度20μΜ。继续培养24 小时后离屯、收集菌体。采用双蒸水清洗菌体3遍后，将菌体65°C干燥3-5天，干燥的酵母块进 行微波消解后，采用火焰法原子吸收光谱测定酵母细胞中儒的积累。
[0107] 在本发明中，转化五个烟草金属硫蛋白基因重组载体PYES260的两种酵母菌株(WT 和Aycfl)在添加有15μΜ的CdCl2的培养基中，体内积累的儒均高于转化PYES260空载体的 酵母菌株(见图4所示），运表明烟草金属硫蛋白基因在酵母体内的表达提高了酵母细胞对 重金属儒的富集，促进了工程菌酵母对儒的吸收。本发明公布的五个烟草金属硫蛋白基因 可应用于针对重金属儒污染微生物修复的工程菌遗传改造，用于获得重金属超积累工程 菌，用于环境保护工程中重金属的清除。
[0108] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. NtMTl、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因在改良植物对重金属镉的耐受性或富 集性中的应用，所述NtMT 1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的cDNA分别为如SEQ ID NO. 1， SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQ IDN0·1，SEQIDN0·3，SEQIDN0·5、SEQIDN0·7、SEQIDN0·9互补配对的的核苷酸序 列，或分别为编码SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.4，SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10所 示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。2. 氨基酸序列分别如SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.4，SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白NtMTl，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5在改良植物对重金属镉的耐 受性或富集性中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述植物为水稻。4. 插入有权利要求1中所述的NtMTl、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的阅读框核苷酸 序列的酿酒酵母重组表达载体，所述NtMTl、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5基因的cDNA分别为 如SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9所示的核苷酸序 列，或分别为与SEQIDN0·1，SEQIDN0·3，SEQIDN0·5、SEQIDN0·7、SEQIDN0·9互补 配对的的核苷酸序列，或分别为编码SEQ ID NO. 2,SEQ ID NO.4, SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。5. 权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在改良工程菌株酵母对重金属镉的耐受性 或富集性中的应用。6. 权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体在培育改良对重金属镉的耐受性或富集性 的烟草中的应用。7. -种酿酒酵母，其特征是，其转化有权利要求4所述的酿酒酵母重组表达载体。8. 权利要求7所述的酿酒酵母在对环境中重金属镉污染的微生物修复工程中的应用。9. 一种改良烟草中重金属镉的耐受性或富集性的生物制剂，其特征是，其活性成份来 源于权利要求3所述的酿酒酵母重组表达载体或权利要求7所述的酿酒酵母，或其活性成份 含有NtMT 1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因，所述NtMT 1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、NtMT5 基因分别为如SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9所示的 核苷酸序列，或分别为与SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID NO.9互补配对的核苷酸序列，或分别为编码SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。10. -种调控烟草中重金属镉的耐受性或富集性的方法，其特征是，该方法步骤中包括 调控烟草中 NtMT 1、NtMT2、NtMT3、NtMT4、和/或NtMT5基因的表达，所述 NtMT 1、NtMT2、NtMT3、 NtMT4、NtMT5基因分别为如SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或分别为与SEQ ID NO. 1，SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5、SEQ ID N0.7、SEQIDN0.9互补配对的核苷酸序列，或分别为编码SEQIDN0.2，SEQIDN0.4，SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明公开了五个烟草金属硫蛋白NtMT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5及其编码基因在改良植物对重金属镉的耐受性或富集性中的应用。该基因在工程菌酿酒酵母中表达可以提高酵母对镉的耐受能力，同时使酵母中镉的含量提高，表明五个烟草金属硫蛋白具有重金属镉解毒的能力；此外，表达五个烟草金属硫蛋白基因的酵母对氧化胁迫的耐受性提高。若将该基因在工程菌中进行转基因表达，一方面，可以改变工程菌对重金属镉耐受性，另一方面也可以提高转基因工程菌对重金属镉的积累，从而将该工程菌应用于环境污染中重金属镉的微生物修复工程。该基因具有应用于植物抗镉的遗传工程育种的潜力，通过调控该基因在植物中的表达，获取重金属镉超积累的转基因植物，用于重金属污染的植物修复工程。
【IPC分类】C12N15/29, A01H5/00, C12N1/19, C07K14/415, B09C1/10, C12N15/81, C12R1/865
【公开号】CN105505950
【申请号】CN201610065122
【发明人】张美 , 莫辉, 郭艳
【申请人】中国科学院华南植物园
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日