核苷酸序列位于同一个开放阅读框内，其中 BT晶体毒素 Cryl为Cry IAb、CrylAc或CrylAa及其修饰改良基因。
[0017] 本发明提供一种由所述抗虫融合蛋白编码基因构建的重组载体，以及由重组载体 转化制备的重组工程菌。
[0018] 本发明涉及一种所述抗虫融合蛋白在制备抗虫药物中的应用，所述虫为水稻、玉 米和棉花的主要鳞翅目害虫，如棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等。
[0019] 本发明涉及一种所述抗虫融合蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为水 稻、玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜或甘蓝等农作物。
[0020] 本发明所述抗虫蛋白、抗虫融合蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，具体为：将含 抗虫蛋白编码基因或抗虫融合蛋白编码基因的载体转入农杆菌中，然后用农杆菌侵染植物 细胞或植物组织，从而获得具有抗虫性能的植物细胞或植物组织。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次公开了一种具有高 杀虫能力的BT晶体毒素 Cry2Aj蛋白，并且设计了用一个CrylAb晶体毒素与该Cry2Aj晶 体毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的Cryl和Cry2晶体毒素物理混合相比，具有如下 优点：杀虫活性提高了 10倍以上，杀虫谱更广；本发明的杀虫蛋白质可以杀灭棉铃虫、甜菜 夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目害虫。此外，本发明发现的融合蛋白 质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。 (四）【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 本发明实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel 编写的 John Wiley and Sons 公司出版的 Current Protocols in Molecular Biology 和 J. Sambrook 等编写 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)出版的 Molecular Cloning :ALabortory Manual，3rd ED.等文献均有详细的说明。
[0024] 实施例1、Cry2Aj基因的获得及表达载体构建
[0025] 编码Cry2Aj杀虫蛋白的基因委托上海生工合成，其DNA序列为SEQ ID NO :2。 Cry2Aj基因被克隆到表达载体pET28a(Novagen, Cambridge, UK)中限制性内切酶BamHI和 SacI的位点之间，得到的载体命名为pET-2Aj，Cry2Aj基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO : 1所不的蛋白质。
[0026] 说明：SEQ ID NO :2核酸序列的表达框从第一个起始密码子（ATG)开始，到最后终 止密码子（TAA)前结束，长度为1902bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位 点，其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
[0027] 实施例2、Cry I Ab-Cry 2Aj融合基因的获得及表达载体构建
[0028] 编码CrylAb_Cry2Aj的杀虫蛋白的融合基因由上海生工合成，在CrylAb和Cry2Aj 之间是一个连接肽，其氨基酸序列是PGKGGG。Cry lAb-Cry2Aj融合基因的DNA序列为SEQ ID NO :4。CrylAb-Cry2Aj融合基因被克隆到表达载体pET28a中限制性内切酶BamHI和SacI 的位点之间，得到的载体命名为pET-lAb-2Aj，CrylAb-Cry2Aj融合基因编码一个氨基酸序 列为SEQ ID No :3的融合蛋白质。
[0029] 因实验需要，委托上海生工合成CryIAb基因，其DNA序列为SEQ ID NO :6。CrylAb 基因被克隆到表达载体pET28a中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体命 名为pET-lAb，CrylAb基因编码一个氨基酸序列为SEQ ID NO :5的蛋白质。
[0030] 说明：SEQ ID NO :4核酸序列的表达框从第一个起始密码子（ATG)开始，到最后终 止密码子（TAA)前结束，长度为3864bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位 点，其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
[0031] SEQ ID NO :6核酸序列的表达框从第一个起始密码子（ATG)开始，到最后终止密 码子（TAA)前结束，长度为1950bp。第一个ATG前的核酸序列GGATCC为BamHI酶切位点， 其后的ACC为核糖体结合位点，最后GAGCTC为SacI酶切位点。
[0032] 实施例3、杀虫蛋白质的制备
[0033] 包含杀虫基因的载体pET-lAb、pET-2Aj和pET-lAb-2Aj分别导入 BL21Star (Escherichia coli)细胞系，在包含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培 养选取单克隆。单个菌落接种到100毫升LB细菌培养液，在37°C下震动培养至0D600 = 〇· 6,然后加 IPTG (Isopropyl-β -D-thiogalactoside)至浓度为0· 5mM，并继续在同样的条 件下培养4小时。培养液经过5000g离心10分钟沉淀大肠杆菌细胞，然后弃上清收集沉淀。 沉淀中加30毫升pH7. 0、20mM Tris-HCl缓冲液，超声破碎，分别获得杀虫蛋白Cry lAb、杀虫 蛋白Cry 2Aj和杀虫蛋白Cry IAb-Cry 2Aj。这样获得
[0034] 的重组蛋白质用来进行杀虫活性的测定。
[0035] (I)LB固体培养基组成为：
[0036]
[0037] LB细菌培养液组成为：
[0038]
[0039] 实施例4、在大肠杆菌中表达的杀虫蛋白的杀虫活性测定
[0040] 实施例3所获得的杀虫蛋白CrylAb、杀虫蛋白Cry 2Aj和杀虫蛋白Cry lAb-Cry2Aj各100微升单独或者混合涂在0. 5平方厘米昆虫人工饲料的表面，饲养新生一 龄幼虫用来进行杀虫活性测定。以含有pET28a空载体的BL21Star为阴性对照，准备方法 与实施例3类同。饲养7天以后统计杀虫率，结果如表1所示。
[0041 ]表 1、CrylAb、Cry2Aj 和 CrylAb_Cry2Aj 的杀虫率
[0042]
[0043] 所述昆虫人工饲料制备方法为：（1)将玉米面1200g、黄豆面600g、酵母粉540g放 入牛皮纸袋，再放入烘箱中120°C 2小时。（2)将步骤（1)烘好的原料与300g白糖放入一小 锅内，在大锅内烧水6000ml，温水时向小锅内放入大锅一半的温水，用勺子搅拌均匀，同时 将100g琼脂粉放入大锅内，放入IIg山梨酸和IIg对羟基苯甲酸甲酯，熬到开锅，搅拌，加 入小锅内的东西，熬，加入KOH(22. 4g+100ml水），再加10%甲醛90ml (40%甲醛30ml+90ml 水），再加乙酸240ml (180ml冰乙酸+320ml水，然后取40ml上述乙酸溶液再+200ml水）放 入锅内，搅拌均匀，加入37. 5g抗坏血酸和90ml维生素，搅拌均匀，分装到4个白瓷盘中，置 于4度冰箱备用。
[0044] 结果表明，Cry2Aj对棉铃虫有100 %的杀虫活性，对玉米螟有80 %的杀虫活性； 融合蛋白质CrylAb-Cry2Aj的杀虫活性比单独的Cry2Aj或者CrylAb明显提高，同时也比 CrylAb和Cry2Aj混合的杀虫活性明显提高。
[0045] 实施例5、农杆菌转化T-DNA载体的构建
[0046] 农杆菌转化 T-DNA 载体是基于 pCambia 1300 (CAMBIA, Canberra, Australia)载体 而构建的。编码杀虫蛋白质的合成核苷酸序列Cry2Aj(SEQ ID N〇:2,5'端被设计上BamHI 位点，3'端被设计上 SacI 位点，BamHI-SacI 酶切片段）和 CrylAb-Cry2Aj(SEQ ID No :4,5' 端被设计上BamHI位点，3'端被设计上SacI位点，BamHI