一种肺癌诊断标志物、抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤免疫学领域。本发明涉及一种新型肺癌肿瘤标志物N3G4,以及抗 N3G4的单克隆抗体LC128。细胞和组织学水平证明：LC128特异性识别人肺癌细胞及人肺 癌组织。本发明还涉及一个免疫磁珠法检测人肺癌的方法。该检测方法所检测的抗原为 本发明中的人的肺癌新型标记物N3G4,检测抗体为本发明中抗人肺癌N3G4的单克隆抗体 LC128〇
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前我国最常见的恶性肿瘤之一。我国肺癌的发病率与死亡率正逐年增 高。全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示，2010年，我国新发肺癌病例60. 59万，居恶 性肿瘤首位，占恶性肿瘤新发病例的19. 59%。并且多数患者发现时已是晚期，失去早期治 疗的机会。肺癌主要有小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC) (16.8% )和非小细 胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC) (80.4% )两种类型。非小细胞肺癌主要有 三类：鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。其中肺腺癌是最常见的肺癌形式（30% -65% )。 肺癌的病因至今尚不完全明确。
[0003] 如何实现肺癌的早期诊断和治疗是当今医学界肺癌研宄的热点课题。据统计， 早期非小细胞肺癌的5年生存率高达80%，而非小细胞肺癌总的5年生存率仅为15% (Mu1shine JL, Sullivan D. Clinical p ractice. Lung cancer screening[J]. N Engl J Med, 2005, 352 (26): 271422720.)。可见，肺癌的早期诊断和治疗显得极其重要。目 前用于肺癌的诊断方法主要有：痰细胞学检查、影像学检查、内窥镜检查以及活组织检 查。痰细胞学具有极低的灵敏度。肺癌的影像检查方法主要包括：X线胸片、CT、磁共振 成像（magnetic resonance imaging, MRI)、超声、核素显像、正电子发射计算机断层扫描 (positron emission tomography/computed tomography，PET_CT)等方法，但影像学检查 也是相对不灵敏的，要求病变大小大于1厘米才可见。内窥镜检查要求肿瘤在内窥镜可靠 近的气道内可见。虽然目前最公认的诊断方法是低剂量的胸部CT，但灵敏度也有局限，与X 线胸片一样，CT涉及电离辐射，其自身也引起癌症。
[0004] 但由于早期患者症状不典型，诊断率仅为15% (祝晋芳等，肺癌血肿瘤标志物早 期诊断研宄进展[J].医学综述，2010, 16 (7): 1015-1018)。传统的肺癌筛查方法由于其特 异性及灵敏性有限，再加上过程痛苦、费用高等缺点使高危人群的依从性差，因此传统的肺 癌筛查方法并没有降低肺癌的病死率。因此，需要可以替代或补充传统肺癌筛查的方法，以 提高肺癌早期的诊断率，以及减少外科手术的次数以降低手术并发症的危险。近年来，肿瘤 标志物由于其特异性和灵敏度高等特点，对肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗具有提供 指导意义。有研宄表明整合素0 1参与肺癌细胞的侵袭和转移（宫雪，陈骊珠等，整合素与 肿瘤侵袭和转移的研宄进展[J]. 2007, 23(15) =2288-2289.)。整合素是由a、0两个亚基 构成的异源二聚体，其功能涉及细胞与基质、细胞与细胞的粘附，参与细胞信号转导，调节 的细胞增殖与凋亡，以及肿瘤细胞的粘附、侵袭、转移和血管形成。整合素0 1亚基（⑶29) 与a 3亚基（⑶49c)结合形成二聚体。整合素a 30 1主要街道细胞与细胞外基质成分直 接的粘附，此外整合素a 30 1的异常修饰导致肿瘤细胞恶性程度的改变。因此发现新型整 合素修饰形式对于肺癌的诊断和治疗具有积极的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明利用新鲜的人肺癌组织免疫小鼠，获得杂交瘤细胞株。用ELISA的方法 筛选到一株能与人肺癌组织高度特异结合的抗体LC128,属于IgGl亚类。免疫组织化学 和流式细胞术证实，LC128抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系A549、Calu-3、NCI-H1975、 NCI-H460、SK-LU-1、NCI-H157呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺癌细胞无交叉 反应。
[0006] 本发明通过免疫沉淀结合质谱与糖芯片结果鉴定，LC128抗体识别的抗原是一种 异常糖基化的整合素0 1亚基，其定位于细胞膜上，其表位为： Neu5Ac a 2_6GlcNAc 0 l_3Gal 0 l_3GlcNAc 0 l_3Gal 0 1 属于全新的肺癌标志物。
[0007] 本发明将LC128抗体偶联纳米磁颗粒，制备成抗肺癌免疫磁珠（LC128-MB)。将其 与病人胸腔积液混合，捕获并富集脱落的肺癌细胞，经瑞氏吉姆萨病理染色，在显微镜下进 行诊断。该试剂盒适用于肿瘤病人的早期筛查、预后监测及病理辅助诊断。
[0008] 本发明的创新性在于：（1)筛选并制备了一种抗人肺癌的单克隆抗体LC128,该 抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系 A549、Calu-3、NCI-H1975、NCI-H460、SK-LU-1、NCI-H157 呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺癌细胞无交叉反应；（2)揭示了 LC128抗体识 别的抗原表位为 Neu5Ac a 2-6GlcNAc 0 l-3Gal 0 l-3GlcNAc 0 l-3Gal 0 1，为全新的肺癌标志物；（3) 开发了一种基于LC128抗体的高灵敏度的用于检测人肺癌的免疫磁珠方法。 发明详述
[0009] 本发明提供了一种全新的人肺癌肿瘤标志物一异常糖基化的整合素0 1亚基， 命名为N3G4。并获得了产生抗N3G4的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌 产生了单克隆抗体LC128,单克隆抗体LC128识别的抗原表位为他1154〇(12-661〇嫩(^1-3Gal 0 l-3GlcNAc 0 l-3Gal 0 1。该单克隆抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系A549、Calu-3、 NCI-H1975、NCI-H460、SK-LU-1、NCI-H157呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺 癌细胞无交叉反应。本发明还提供了基于单克隆抗体LC128的体外肺癌诊断的免疫磁珠 (LC128-MB)诊断方法。
[0010] 更具体地，本发明的一个目的是提供了一种异常糖基化的人肺癌肿瘤标志物 N3G4,其为异常糖基化的整合素整合素M亚基，其特征是在M亚基上包含抗原表位的糖 结构 Neu5Ac a 2_6GlcNAc 0 l_3Gal 0 l_3GlcNAc 0 l_3Gal 0 1。
[0011] 在一个优选方案中，所述整合素整合素0 1亚基的氨基酸序列如SEQ ID No: 1所 不〇
[0012] 本发明的另一个目的是提供针对本发明所述的人肺癌标志物N3G4的抗体，其能 够特异性识别所述作为抗原表位的糖结构Neu5Ac a 2-6GlcNAc 0 l-3Gal 0 l-3GlcNAc 0 1-3 Gal |3 1，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
[0013]本发明的另一个目的是提供一种用于检测人肺癌的试剂盒，其包含本发明上述的 抗体LC128。一个优选实施方案中，所述的抗体是抗人肺癌N3G4的单克隆抗体LC128,该单 克隆抗体由保藏号为CGMCC NO. 10414的杂交瘤细胞株分泌。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种缀合物，其中包含所述抗人肺癌N3G4与选自以 下组分组成的物质缀合：生物标记物、抗肿瘤药物、毒素和放射性活性剂。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测或治疗人肺癌的试剂盒，其中包含本发 明上述的抗体。
[0016] 在一个优选实施方案中，在所述的试剂盒中，所述的检测是通过单克隆抗体 LC128偶联纳米磁颗粒进行，优选将LC128抗体偶联纳米磁颗粒，制备成抗肺癌免疫磁珠 (LC128-MB)。在一个优选实施方案中，所述待测样品是含人肺癌脱落细胞的人胸腔积液或 痰液。
[0017] 本发明的另一个目的是提供分泌抗人肺癌N3G4的单克隆抗体LC128的杂交瘤 细胞株，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保持地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，其保藏 号为CGMCC N0. 10414,其分类命