阻断猪pd-1/pd-l1通路的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子免疫学，具体涉及阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽及其应用。【背景技术】
[0002] 免疫系统存在着活化和抑制调节两种信号通路，免疫活化和抑制调节相互协调共 同维持免疫系统动态平衡。TCR或BCR与MHC分子-抗原肽和共刺激信号通路B7/⑶28共 同调节t细胞或b细胞活化；另外，t细胞表面存在一系列的免疫抑制性表面分子，如ro-i、 (^1^-4、11111-3、10)5、1^1、31^、1^-3等，与其相应配体结合激活免疫负调节通路，导致丁 细胞功能衰竭。其中ro-1/PD-Ls通路是目前研宄的热点，研宄表明，多种急性或慢性病毒 性疾病过程中，ro-1及其配体ro-Li和ro-L2表达量升高，ro-i与其配体相互结合后，激 活ro-l下游通路，抑制了 T细胞抗病毒细胞因子分泌、增殖和CTL等功能，导致机体免疫抑 制。有趣的是用抗ro-i或ro-Li的抗体阻断ro-i/PD-Ls通路后，可以逆转已衰竭t细胞 的功能，为提高免疫水平和治疗病毒性免疫抑制性疾病提供新的思路和方法。
[0003] PD-L1比ro-L2的分布更加广泛，如表达ro-Ll的细胞种类较多，如B细胞、DC、巨 噬细胞、骨髓源肥大细胞、T细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、胰岛细胞星形胶质 细胞等，而H)-L2仅表达于DC、巨噬细胞、记忆性B细胞等，所以在阻断ro-1/PD-Ls通路逆 转T细胞功能方面，PD-1/ro-Ll通路比TO-1/PD-L2通路显得更加重要。相关研宄表明，可 溶性ro-1重组蛋白免疫小鼠后，可以显著提高T细胞抗病毒或抗肿瘤免疫反应，达到清除 病原或杀死肿瘤细胞的目的，为开发可溶性蛋白ro-i和ro-Ls的药物或疫苗奠定基础。目 前，PD-1和ro-Ls的晶体结构已被解析，在ro-i与ro-Ll复合物结合区域中，PD-1的n末 端结合区域与ro-Li的c端结合区域位于复合物的同一侧面，ro-i的两个e折叠链分别 位于ABED和A' GFCC C"区域，PD-L1的两个0折叠链分别位于AGFW C"和BED区 域，为筛选和鉴定阻断ro-1/PD-Ls通路的多肽表位提供有利信息。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽及其应 用。
[0005] 本发明的技术方案是：阻断猪ro-1/PD-Ll通路的多肽，其特征在于，其氨基酸序 列为：CTRRNDSGTYFCGAHLPPKTQINESHQAKLT。
[0006] 本发明的另一目的在于，提供了阻断猪ro-1/PD-Li通路的多肽在提高体液免疫 中的应用。
[0007] 阻断猪ro-i/PD-Li通路的多肽作为佐剂在提高体液免疫中的应用。
[0008] 阻断猪ro-1/PD-Li通路的多肽在提高细胞免疫中的应用。
[0009] 阻断猪ro-1 /PD-L1通路的多肽的用途，用于结合PBMC上的ro-L 1，阻断ro-1 / PD-L1通路，提高PBMC增殖。
[0010] 本发明设计合成了基于ro-1/PD-Li复合物结合位点的系列多肽，对其阻断ro-1/ PD-L1通路后的免疫效应进行研宄，为获得提高免疫效应的多肽药物或疫苗佐剂奠定基础。【附图说明】
[0011] 图la是PBMC与FITC结合的结合流式散点图。
[0012] 图lb是PBMC与FITC结合的流式荧光曲线图。
[0013] 图lc是PBMC与本发明多肽结合散点图。
[0014] 图Id是PBMC与本发明多肽结合曲线图。
[0015] 图2a是阴性对照组刺激PBMC增殖的流式图。
[0016] 图2b是本发明多肽刺激PBMC增殖的流式图。
[0017]图3a是本发明多肽高效液相图。
[0018]图3b是本发明多肽的质谱图。
[0019]图4是本发明多肽作为佐剂免疫小鼠的抗体效价变化。
[0020] 图5a是FITC对照组。
[0021] 图5b是PD-15与重组蛋白PD-L1的结合。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明做详细说明。
[0023] 多肽标记FITC
[0024]用 FITCAntibody Labeling Kit试剂盒将 FITC 标记于多肽上，FITCAntibody Labeling Kit可以将FITC连接于氨基酸残基中的巯基、咪唑基、羰基和酪氨酰等基团，步 骤如下：
[0025] (1)多肽准备，向0? 5mL 2mg/mL多肽溶液中加入40 y L 0? 67mol/L的硼酸钠溶液， 并将多肽浓度调制lmg/mL;
[0026] (2) 0. 5mL多肽加入装有约30 y L FITC试剂管中，混匀使试剂充分溶解，室温避光 孵育60min;
[0027] (3)往反应管中加入400 y L纯化树脂，将反应管放入微型收集管中，1000r/min室 温离心30~45sec，弃掉收集管；
[0028] (4)把反应管放入新的收集管中，加入250~270 y L的标记反应液（0? 05mol/L 硼酸钠溶液），混匀，l〇〇〇r/min室温离心30~45sec，收集液即为标记并纯化多肽，分装一 20 °C避光保存。
[0029] FITC标记多肽与PBMC结合
[0030] PBMC 分离
[0031] (1)颈静脉采集正常猪抗凝血5mL，抗凝剂为10%柠檬酸钠，全血与抗凝剂比例为 10:1，抗凝血与等量PBS轻轻混勾；
[0032] (2)取4mL淋巴细胞分离液于15mL玻璃离心管中，将上述混匀血10mL沿管壁慢慢 加入离心管中（注：动作要轻，不能混匀），水平转子2000r/min，室温离心20min;
[0033](3)用毛细管吸取血浆层与分离液之间的白色细胞薄层（单个核细胞），移入新的 15mL玻璃离心管中，加入2~5倍体积PBS，轻轻悬浮细胞，1000r/min，室温离心10min，弃 上清，加入10mL PBS，轻轻悬浮细胞，重复离心一次，弃上清；
[0034] (4)观察白细胞中红细胞量，适当加入1~2mL红细胞裂解液，冰上裂解红细胞 5min，加入10mL PBS，1000r/min，室温离心10min，弃上清，加入0.5mL PBS，悬浮细胞，即为 PBMC细胞悬液。
[0035] PD-15 与 PBMC 结合
[0036] PBMC来自于临床感染PCV2的断奶仔猪，用PBS调整PBMC浓度至106个/mL，取10 6 个PBMC加入终浓度为0. lmg/mL的FTIC-多肽（总体积200 y L)，同时设FITC为阴性对照 组，混合均匀后冰上避光结合2h，期间多次悬浮细胞，PBS洗涤6次，加入0. 5mL PBS悬浮细 胞，200目尼龙网过滤后，流式细胞仪和荧光显微镜检测多肽与PB